基因组整合型表达盒交换技术：为酿酒酵母菌株工程带来模块化革命

本研究针对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株工程中表达盒难以标准化替换的瓶颈问题，开发了基于CRISPR-Cas9/Cas12a的基因组整合型表达盒交换系统。通过设计特异性条形码(BRC)标记表达盒，实现了已整合表达盒的高效(~90%)替换或移除，将合成生物学的模块化原则延伸至菌株层面，为微生物细胞工厂的灵活改造提供了创新工具(Easy-MISE Toolkit)。

　　

在合成生物学领域，微生物细胞工厂的构建往往面临"一次性集成"的困境——一旦外源基因表达盒被整合到宿主基因组中，后续修改就需要从头开始。这种刚性设计模式严重制约了菌株的迭代优化效率，特别是在需要测试不同酶组合或升级新发现的高效酶变体时。传统方法要求研究者必须从最后一个不含目标表达盒的亲本菌株重新开始，导致工程流程冗长且资源浪费。

意大利米兰比可卡大学生物技术与生物科学系的Pietro Butti等研究人员在《FEMS Yeast Research》发表的研究，创新性地将CRISPR介导的DNA双链断裂(DSB)修复机制与合成生物学标准化原则相结合。该团队开发的系统通过在表达盒两侧引入特异性条形码(BRC)，使已整合的表达盒成为可靶向操作的模块化单元。这些条形码包含Cas9(PAM序列CGG)和Cas12a(PAM序列TTTA)的识别位点，当需要修改时，只需针对特定条形码设计CRISPR引导RNA(gRNA)，并提供新的表达盒作为修复模板，就能实现表达盒的精准替换或移除。

研究采用的关键技术包括：1) 基于Python脚本的人工条形码设计，确保20bp序列在酿酒酵母CEN.PK113-7D基因组中的唯一性；2) 改进的Easy-MISE工具包，将条形码整合到终止子和适配器元件中；3) 单质粒pCEC-red CRISPR-Cas9系统简化编辑流程；4) 流式细胞术定量评估GFP/mCherry表达盒交换效率。

Genomically integrated cassettes swapping: bringing modularity to the strain level in Saccharomyces cerevisiae

研究人员通过改造Easy-MISE工具包，构建了携带人工条形码BRC-A1的GFP表达盒(S1_GFP-A1)，并整合到X3基因座。PCR和测序验证显示，使用针对BRC-A1的CRISPR-Cas9系统时，GFP与mCherry表达盒的交换效率达90%，而仅条形码交换的"部分替换"占10%。流式细胞术在48小时检测到89.28%±3.22的mCherry阳性群体，证实了系统的高效性。

Cassette swapping assessment: PCR

对20个转化子的分析显示，18个克隆(90%)成功完成完整表达盒交换，2个克隆出现仅条形码交换的现象。测序发现这些"部分替换"克隆在共享启动子和终止子区域存在2-4个碱基突变，推测是相邻DSB修复过程中的空间干扰所致。

Cassette swapping assessment: flow cytometry

流式分析显示，在抗生素选择压力下，转化群体在48小时达到稳定状态，mCherry阳性/GFP阴性群体占比89.28%，与PCR结果高度一致。阴性对照中未转化细胞被有效抑制，证实了筛选系统的可靠性。

研究结论部分强调，这套系统首次将合成生物学的模块化原则延伸到菌株层面，使微生物细胞工厂像电子工程中的模块化设备一样可随时升级。通过条形码循环利用策略(BRC-X3等)，仅需少量人工条形码即可支持无限次的表达盒替换。与需要标记基因的双步等位基因交换技术(效率87.5%)相比，该系统更高效且标准化。

讨论部分指出，虽然观察到少量部分替换现象，但通过优化同源臂设计和增加筛选克隆数即可解决。该系统与现有CRISPR-Cas12a系统的兼容性(效率87.5%)进一步拓展了应用灵活性。未来可望将该原理应用于更复杂的酵母工具包(如Yeast Toolkit)，或通过定制条形码拓展至其他微生物宿主，为合成生物学和代谢工程领域带来革命性的菌株工程新范式。