基于一锅法SHERLOCK技术的环形泰勒虫快速检测方法建立及现场应用评价

针对发展中国家热带泰勒虫病现场检测技术匮乏的问题，兰州兽医研究所团队开发了以SPAG基因为靶标的一锅法SHERLOCK检测体系。该技术整合RPA扩增与CRISPR-Cas13a系统，可在37℃条件下60分钟内特异性识别103 copies/μL的T. annulata基因组，与PCR法符合率达100%，并通过裂解液直接处理血样简化基因组提取步骤，为基层防控提供便携化解决方案。

　　

在热带和亚热带地区，由蜱虫传播的环形泰勒虫（Theileria annulata）引发的热带泰勒虫病每年威胁着2.5亿头牛的生命。这种寄生虫通过破坏牛的红细胞和淋巴细胞，不仅造成畜牧业重大经济损失，更因现有检测技术对专业设备和人员的依赖，使得发展中国家难以实现早期防控。显微镜检查虽成本低廉但易误诊，而PCR和ELISA等方法又受限于基础设施条件。这种诊断困境催生了兰州兽医研究所团队开展一项革新性研究——开发适合野外应用的核酸快速检测技术。

研究团队选择环形泰勒虫的SPAG基因作为分子靶标，该基因在虫体不同发育阶段均稳定表达。通过将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas13a系统整合，建立了一锅法SHERLOCK检测平台。关键技术包括：1）设计特异性RPA引物和crRNA；2）优化37℃恒温反应条件；3）采用横向流动试纸条可视化结果；4）直接使用裂解液处理感染牛血样跳过DNA提取步骤。46份新疆地区临床样本的验证显示，该方法与常规PCR的检测符合率高达100%。

【优化反应温度和时间】
温度梯度实验表明30-42℃范围内均可检出目标序列，其中37℃和40℃时信号最强。时间测试确认60分钟反应即可获得清晰条带，确立了最优反应参数。

【特异性测试】
横向流试纸条仅对T. annulata基因组产生双条带反应，与T. sinensis等近缘种及Babesia属病原体无交叉反应，证实crRNA设计的严格特异性。

【灵敏度评估】
检测下限达到1×10³
copies/μL，虽略低于传统PCR，但完全满足现场筛查需求。直接使用裂解液处理样本时灵敏度有所下降，但显著提升了操作便捷性。

【讨论与结论】
该研究首次将SHERLOCK技术应用于原虫检测领域，其创新性体现在：1）突破冷链运输限制，仅需恒温水浴锅即可完成检测；2）通过裂解液处理实现"样本进-结果出"的极简流程；3）试纸条判读模式降低对专业人员的依赖。尽管在灵敏度上作出妥协，但该技术为资源匮乏地区提供了可行的解决方案。研究团队建议后续开发冻干试剂进一步提升现场适用性，这项发表于《Veterinary Parasitology》的成果，为热带泰勒虫病的群防群控提供了技术范式。

（注：全文严格依据原文数据呈现，技术术语如SPAG基因全称为sporozoite surface antigen gene，SHERLOCK指Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）