综述：多重CRISPR/Cas与Argonaute检测技术：策略、挑战与展望

（编辑推荐）本综述系统阐述了CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列及其关联蛋白）与Argonaute（Ago）作为可编程核酸酶在多重检测中的前沿应用，通过空间分离、颜色标记、序列偏好等策略突破检测壁垒，兼具超高灵敏度与单碱基特异性，为疾病诊断、食品安全等领域提供革新性分子工具。

　　

Abstract
随着生物分析领域对多重核酸同步检测需求的增长，CRISPR/Cas系统与Argonaute凭借其可编程特性及精准切割能力，成为新一代分子检测工具的核心。本文全面梳理了两类核酸酶的进化分类（如Cas9、nCas9、dCas9及Pf
Ago、Tt
Ago等），并剖析当前多重检测面临的信号读限、交叉干扰等瓶颈，为开发高特异性、高灵敏度检测技术提供理论框架。

Introduction
核酸测试（NAT）在疾病诊断与环境监测中至关重要，但传统PCR依赖复杂热循环设备，而等温扩增技术（如RPA、LAMP）易受非特异性扩增干扰。CRISPR/Cas系统通过trans
-切割活性（如Cas12切割ssDNA、Cas13切割RNA）实现信号放大，结合微流控芯片或液滴技术实现空间分离，显著提升多重检测效率。Argonaute家族（如Cb
Ago）的序列特异性识别进一步拓展了检测靶标范围。

CRISPR/Cas and Argonaute toolbox
CRISPR/Cas系统由crRNA引导的Cas效应蛋白（如Cas9通过HNH与RuvC结构域切割DNA）构成，而Argonaute利用短向导RNA（sgRNA）靶向切割核酸。两类工具均能通过工程化改造（如dCas9失去切割活性但保留结合能力）适配多重检测需求。

Barriers of current multiplexed strategies
多重检测的核心挑战在于信号通道有限（如荧光标记易重叠）、试剂消耗量大，以及靶标间交叉反应。微流控芯片通过物理分隔反应单元可部分解决此问题，但样本前处理与灵敏度平衡仍需优化。

Spatial/local separation
微流控技术将不同CRISPR/Cas检测体系集成于独立微腔室，实现并行检测。例如，纳米孔阵列可同步分析多种病原体核酸，而液滴微流控能单次生成数千个反应单元，大幅提升通量。

Conclusions
尽管CRISPR/Cas与Argonaute多重检测技术展现出巨大潜力，但样本前处理标准化、特异性优化及设备微型化仍是未来突破方向。该领域的进展将推动便携式诊断设备的开发，为精准医疗提供新范式。

（注：全文严格基于原文内容缩编，未新增观点或数据）