构建用于产纤维素菌株Kosakonia oryzendophytica遗传操作的合成生物学工具包

为解决细菌纤维素(BC)生产菌株遗传工具匮乏的问题，研究人员开发了针对高产BC菌株Kosakonia oryzendophytica的合成生物学平台。通过系统表征启动子、RBS等调控元件（表达强度1.84%-169%），并建立CRISPR/Cas9基因组编辑系统（效率≈100%），成功敲除bcsA、fbp等关键基因。该研究为定制化BC功能材料开发提供了关键技术支撑。

　　

细菌纤维素(Bacterial Cellulose, BC)作为一种由葡萄糖聚合形成的纳米材料，因其独特的三维网状结构和卓越的物理化学特性，在医疗敷料、组织工程和柔性电子等领域展现出巨大潜力。然而，传统BC生产菌株Komagataeibacter xylinus存在培养周期长、产量受限等问题，而新发现的超高产菌株Kosakonia oryzendophytica又缺乏系统化的遗传操作工具，严重制约了BC材料的性能优化与应用拓展。

针对这一技术瓶颈，研究人员在《Synthetic and Systems Biotechnology》发表的研究中，构建了首个针对K. oryzendophytica的合成生物学工具包。研究通过组合使用分子克隆、荧光报告系统定量表征和CRISPR-Cas9基因编辑等技术，建立了从基因表达到基因组精确编辑的完整技术体系。

【调控元件系统表征】
通过构建包含不同启动子（如LacO1）、核糖体结合位点(RBS)和终止子的表达模块，采用荧光蛋白报告系统定量分析，发现各元件表达强度存在1.84%至169%的动态范围，为后续代谢通路优化提供了精准调控工具。

【CRISPR/Cas9编辑系统优化】
创新性地协调表达λ Red重组酶（促进同源重组）与Cas9核酸酶，实现了近乎100%的编辑效率。通过设计特异性sgRNA靶向bcsA（纤维素合酶催化亚基）和fbp（果糖-1,6-二磷酸酶）等基因，获得稳定遗传的缺失突变株。

【表型验证】
扫描电镜观察显示ΔbcsA和Δfbp突变体完全丧失BC合成能力，证实了这些基因在纤维素生物合成中的核心作用。同时通过galU（UTP-葡萄糖焦磷酸化酶）敲除实验验证了工具包在代谢工程中的应用潜力。

该研究构建的合成生物学平台解决了K. oryzendophytica遗传改造的技术难题，其创新性体现在：1）建立了首个覆盖基因表达调控到基因组编辑的全套工具；2）通过λ Red/Cas9协同作用实现了近乎完美的编辑效率；3）为BC材料的性能定制提供了可编程的遗传操作基础。这些突破不仅推动了纤维素基生物材料的开发进程，其模块化设计思路更为其他非模式微生物的遗传改造提供了范式参考。