纳米颗粒介导的PD-L1和Galectin-9双基因编辑增强癌症免疫治疗的机制研究

推荐：本研究针对肿瘤免疫治疗中PD-1/PD-L1和TIM-3/Gal-9双重免疫检查点抑制的临床挑战，开发了pH响应性磷酸钙纳米颗粒（CaP NPs）递送CRISPR-Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP），实现肿瘤局部PD-L1和Gal-9双基因敲除。该策略不仅增强T细胞抗肿瘤活性，还通过Ca2+ 超载触发损伤相关分子模式（DAMPs）释放，激活系统性免疫应答，显著抑制原发灶和远端肿瘤生长，并降低循环肿瘤细胞（CTCs）的转移潜能。发表于《Biomaterials》的这项研究为实体瘤免疫治疗提供了创新性解决方案。

　　

在癌症免疫治疗领域，PD-1/PD-L1抑制剂虽取得突破，但面临响应率低、系统毒性等问题。更棘手的是，肿瘤微环境（TME）中TIM-3/Gal-9通路的共表达会进一步加剧T细胞耗竭。传统抗体阻断疗法仅暂时抑制免疫检查点分子，而肿瘤细胞持续表达这些分子导致疗效受限。如何实现长效免疫激活并克服转移风险，成为亟待解决的科学难题。

针对这一挑战，McGill大学的研究团队创新性地将基因编辑技术与纳米递送系统结合，开发了可同时靶向PD-L1和Gal-9的CRISPR-Cas9递送平台。研究人员设计pH响应性磷酸钙纳米颗粒（CaP NPs），通过局部注射实现双基因敲除，并发现纳米颗粒降解引发的Ca²⁺
超载可激活先天免疫。这项发表于《Biomaterials》的研究，为改善实体瘤免疫治疗提供了"基因编辑+免疫激活"的双重策略。

关键技术包括：（1）聚合物辅助共沉淀法制备RNP负载的CaP NPs；（2）T7E1酶切和流式细胞术验证体外基因编辑效率；（3）建立B16F10黑色素瘤和CT26结肠癌小鼠模型；（4）通过IVIS成像分析纳米颗粒体内分布；（5）ELISA和流式检测免疫细胞亚群及细胞因子。

【研究结果】
2.1 RNP@CaP NPs的表征与体外基因编辑效率
通过SEM/TEM证实纳米颗粒呈240 nm球形，pH响应性释放RNP。在B16F10和CT26细胞中，PD-L1和Gal-9基因编辑效率分别达27-32%，蛋白表达显著降低。

2.2 RNP@CaP NPs诱导DAMP释放和免疫应答
CaP NPs处理虽未显著杀伤细胞，但诱导钙网蛋白（CRT）暴露、ATP和HMGB1释放。共培养实验显示树突状细胞（DC）成熟率提升，巨噬细胞向M1表型极化。

2.3 体内基因编辑治疗原位黑色素瘤
荧光标记显示纳米颗粒在肿瘤部位滞留72小时。局部注射使肿瘤组织PD-L1和Gal-9蛋白表达降低50%以上，显著抑制肿瘤生长。免疫分析发现CD8⁺
T细胞浸润增加3倍，Treg细胞减少，促炎因子IFN-γ、TNF-α水平升高。

2.4 局部治疗抑制远端肿瘤
双肿瘤模型显示，仅处理原发灶可使未治疗的远端肿瘤体积缩小60%。远端肿瘤虽无基因编辑证据，但CD8⁺
T细胞比例增加，证实系统性免疫激活。

2.5 循环肿瘤细胞表型改变
从治疗组血液分离的循环肿瘤细胞中，34%显示PD-L1/Gal-9双敲除。静脉注射预编辑肿瘤细胞的小鼠肺转移灶减少70%，肺组织CD3⁺
CD8⁺
T细胞增加2倍。

【结论与意义】
该研究首创性地将CaP NPs的免疫激活特性与CRISPR基因编辑技术结合，通过局部干预实现全身抗肿瘤效应。其创新性体现在：（1）双靶点编辑解除PD-L1和Gal-9的免疫抑制；（2）Ca²⁺
超载触发DAMPs释放，增强抗原提呈；（3）改变循环肿瘤细胞表型抑制转移。这种"纳米颗粒+基因编辑+免疫调节"的多机制协同策略，为克服肿瘤免疫抵抗和转移提供了新思路，尤其适用于浅表可注射的实体瘤治疗。未来需优化纳米颗粒递送效率，并探索其他免疫检查点靶点的组合编辑。