微生物细胞工厂的代谢工程改造实现2′-岩藻糖基乳糖高效生物合成

本研究针对2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)工业化生产的瓶颈问题，通过CRISPR/Cas9技术系统敲除wecB、lacZ等关键基因阻断竞争途径，优化诱导时机并强化NADPH/GTP再生系统，最终使2′-FL产量提升至4.75 g/L，为母乳寡糖的微生物合成提供了可规模化的代谢工程策略。

　　

在婴幼儿配方食品领域，母乳寡糖(HMOs)因其独特的健康功效备受关注。作为含量最丰富的HMOs成分，2′-岩藻糖基乳糖(2′-FL)具有调节肠道菌群、增强免疫和促进神经发育等多重功能。然而传统化学合成法存在步骤繁琐、收率低的问题，酶法合成又受制于昂贵底物成本。虽然微生物发酵被视为绿色替代方案，但现有菌株面临前体供应不足、代谢流分散和辅因子匮乏等瓶颈，导致2′-FL产量难以满足工业化需求。

安徽大学的研究团队在《Process Biochemistry》发表的研究中，通过多维度代谢改造构建了高效合成2′-FL的微生物细胞工厂。研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行靶向基因敲除，结合高效液相色谱(HPLC)进行产物定量分析，并引入辅因子再生系统强化代谢流。

基因删除关键wecB、lacZ和wcaJ基因促进2′-岩藻糖基乳糖生物合成
通过删除UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶(wecB)基因阻断细胞壁前体分流，敲除β-半乳糖苷酶(lacZ)防止底物降解，并去除UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(wcaJ)抑制胞外多糖合成，使2′-FL产量提升至2.25 g/L。

调控诱导时间优化2′-岩藻糖基乳糖合成
发现菌体密度(OD₆₀₀
)1.2时添加IPTG诱导剂可实现代谢活力与酶表达平衡，使产量翻倍至4.06 g/L，生产率达0.06 g/L/h。

探究相关途径调控对2′-岩藻糖基乳糖生物合成的影响
揭示硫代半乳糖苷乙酰转移酶(lacA)缺失会限制乳糖利用，而异柠檬酸裂解酶阻遏蛋白(iclR)敲除扰乱三羧酸循环代谢流，证实这两个节点需保留完整功能。

过表达GsK和Zwf强化2′-岩藻糖基乳糖合成途径
通过表达鸟苷激酶(GsK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Zwf)分别再生GTP和NADPH，解决GDP-甘露糖转化和4-酮基-6-脱氧甘露糖还原的辅因子限制，最终产量提升至4.75 g/L。

该研究创新性地将基因编辑、诱导调控和辅因子工程相结合，逐步破解了2′-FL生物合成的多重限制因素。相较于文献报道的28.2 g/L发酵水平，当前产量仍有提升空间，但采用的甘油-乳糖双底物体系更具成本优势。特别值得注意的是，发现iclR基因在维持中心代谢平衡中的关键作用，为后续改造提供了新视角。研究成果不仅推进了HMOs的工业化进程，其构建的模块化改造策略也可延伸至其他高值寡糖的微生物合成。