CRISPR/Cas9系统高效敲除鸡DF-1细胞IHH基因及其对骨发育信号通路的调控机制研究

本研究针对鸡骨发育关键基因IHH的功能解析需求，利用CRISPR/Cas9技术成功构建IHH敲除的DF-1细胞模型。通过TA克隆筛选出sgRNA1（45%）和sgRNA3（30.8%）高效靶向序列，经流式分选获得100%突变率的单克隆细胞。qPCR检测发现IHH缺失显著下调PTCH1、Smo、Gli1/2等Hedgehog通路基因表达，同时上调ColⅡ表达，为家禽功能基因组研究和骨骼发育机制提供了重要细胞模型与技术支撑。

　　

骨骼发育是影响鸡体重等经济性状的关键因素，而印度刺猬因子（Indian hedgehog, IHH）作为调控软骨形成和骨发育的核心信号分子，其功能缺失会导致"爬行鸡"软骨发育不良表型。然而，IHH基因在家禽中的分子调控机制尚不明确，亟需建立有效的基因编辑模型来解析其功能。中国农业大学的研究团队在《Poultry Science》发表论文，利用CRISPR/Cas9系统成功构建IHH敲除的鸡DF-1细胞模型，揭示了IHH缺失对下游信号通路的调控规律，为家禽分子育种提供了重要理论依据。

研究采用PX458载体构建四种sgRNA表达质粒，通过流式分选获得单克隆细胞株，结合TA克隆测序验证突变效率。qPCR技术检测了PTCH1、Smo、Gli1/2等Hedgehog通路关键基因的表达变化。

【CRISPR/Cas9表达载体构建】
成功构建含sgRNA1-4的PX458重组质粒，经酶切验证载体结构正确，为后续基因编辑奠定基础。

【sgRNA活性评估】
eGFP标记显示转染效率达4.1%-6.9%，TA测序证实sgRNA1（45%）和sgRNA3（30.8%）具有最高突变效率，其中sgRNA1在靶位点诱导7bp缺失突变。

【DF-1细胞基因敲除】
二次转染后获得IHH-sgRNA3-2#单克隆细胞系，测序显示存在两种100%突变类型，包括4bp缺失导致的移码突变，成功建立稳定敲除模型。

【基因表达分析】
qPCR结果显示：IHH敲除组中PTCH1、Smo、Gli1、Gli2和OPN表达显著降低（P<0.05），而ColⅡ表达显著升高，证实IHH通过经典Hedgehog通路调控软骨分化。

该研究首次在禽类细胞中证实CRISPR/Cas9系统对IHH基因的高效编辑能力，揭示IHH通过PTCH1-Smo-Gli信号轴调控ColⅡ和OPN表达的分子机制。建立的IHH敲除细胞模型不仅为家禽骨骼发育研究提供新工具，更为解析"爬行鸡"表型的遗传基础开辟了途径。研究还发现IHH缺失会异常激活ColⅡ表达，这一现象为理解软骨发育障碍提供了新视角。技术层面，45%的敲除效率表明sgRNA1可作为禽类基因编辑的优选靶点，而100%的突变率证实DF-1细胞适合作为CRISPR/Cas9的受体细胞。这些发现为家禽功能基因组研究和精准育种提供了重要技术支撑与理论依据。