巴西利什曼原虫中保守RNA结构的计算发现及结构化lncRNA的功能表征揭示其作为治疗靶点的潜力

本研究通过全基因组比对和计算预测，在巴西利什曼原虫(L. braziliensis)中发现38个保守RNA结构与已知非编码RNA(ncRNA)重叠。研究人员聚焦于具有保守二级结构的lncRNA45，通过基因敲除和回补实验证实其通过结构依赖性机制调控寄生虫适应性，为理解利什曼原虫基因调控网络及开发新型抗寄生虫策略提供了重要依据。

　　

在单细胞真核生物利什曼原虫的生命周期中，寄生虫需要在截然不同的宿主环境（如人类巨噬细胞和沙蝇肠道）间转换，这要求其具备快速适应环境变化的基因表达调控能力。然而，这类生物缺乏典型的RNA聚合酶II启动子，其转录过程呈现多顺反子特性，使得基因调控主要发生在转录后水平。尽管先前研究已在利什曼原虫转录组中鉴定出大量非编码RNA(ncRNA)，但它们的生物学功能和调控机制仍不明确。特别是在缺乏有效疫苗和面临耐药性挑战的背景下，深入理解这些寄生虫的基因调控机制具有重要科学意义和临床价值。

针对这一科学问题，来自中国的研究团队联合国际合作伙伴，在《Non-coding RNA Research》发表了创新性研究成果。研究团队采用计算生物学与实验生物学相结合的策略：首先通过全基因组比对鉴定保守RNA结构；利用RNAz和Infernal预测工具筛选候选ncRNA；选择具有保守结构域的lncRNA45进行功能表征；建立CRISPR/Cas9基因敲除株和回补株；通过生长曲线、RNA荧光原位杂交(FISH)和RNA免疫沉淀(RIP)等技术验证其功能机制。

在基因组分析部分，研究人员对11种锥虫基因组进行质量评估，通过BUSCO分析确认基因组完整性（>90%完整度）。多序列比对鉴定出12,969个与lncRNA注释重叠的窗口，其中142个被确认为结构化RNA候选者（104个新发现，38个与已知ncRNA重叠）。特别值得注意的是，lncRNA45在6种利什曼物种中显示出保守的二级结构域（Locus 709），但其全长序列仅在维尼亚亚属的4个物种中保守。

通过RNA环化实验和Northern blotting，研究团队确认lncRNA45是独立转录的407nt非编码RNA，具有短poly(A)尾（17nt）但缺乏5'端剪接前导序列。RNA FISH显示其主要定位于细胞质，暗示其可能参与转录后调控。功能研究发现，敲除lncRNA45导致寄生虫培养密度显著降低（3.6×10⁷
vs 5.5×10⁷
promastigotes/mL），但倍增时间无显著变化，提示其可能影响细胞存活而非增殖速率。

为验证结构-功能关系，研究人员通过RNAsnp预测发现C50G突变会破坏Locus 709的二级结构（p=0.004）。回补实验证实，野生型lncRNA45能恢复敲除株的生长缺陷，而携带C50G突变的lncRNA45MUT则无此功能，首次证明了利什曼原虫中lncRNA的功能依赖于其二级结构。

在机制探索方面，S1m介导的RNA pull-down鉴定出18个与lncRNA45WT结合的蛋白，其中5个（包括40S核糖体蛋白S9、Nop53和Lupus La同源蛋白）的结合依赖于完整结构域。RIP-seq进一步验证了假设蛋白LBRM2903_280022100与lncRNA45的特异性相互作用。值得注意的是，这些互作蛋白中多个成员（如XRN 5'-3'外切酶和Lupus La同源蛋白）在锥虫生长调控中已有报道，暗示了保守的调控网络。

讨论部分强调，这是首次在锥虫中证实lncRNA的生物学功能依赖于其二级结构。lncRNA45通过与核糖体生物发生和翻译起始相关蛋白（如40S核糖体蛋白S9、Nop53）的相互作用，可能调控寄生虫的蛋白质合成效率。该研究不仅为理解利什曼原虫复杂的转录后调控网络提供了新视角，其发现的结构依赖性相互作用机制也为开发针对结构化RNA靶点的新型抗寄生虫药物奠定了理论基础。特别是考虑到当前治疗药物存在严重副作用和耐药性问题，这些保守的结构化ncRNA区域或可成为极具前景的治疗靶标。