基因拷贝逐步激活策略显著提升CHO细胞重组蛋白表达效价

本研究针对哺乳动物细胞表达系统开发中高表达克隆筛选耗时耗力、高产克隆易丢失的难题，创新性采用CRISPR/Cas9介导的基因逐步激活策略，在CHO细胞中实现2个GFP-Fc和2个BFP-Fc基因的时序性表达调控。结果表明：相较于传统全基因激活（All-in）方式，分步激活可使mRNA表达提升70倍，Fc融合蛋白效价提高一个数量级，为工业化蛋白生产提供了可精准调控表达负荷的新型技术路径。

　　

随着生物制药行业对治疗性蛋白需求的激增，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞作为主流生产平台面临严峻挑战：传统随机整合方法不仅导致基因表达位点不可控，高产克隆更因细胞无法适应骤然增加的蛋白合成负荷而自发沉默或凋亡。这种"高产即自杀"现象使得工业界必须筛选数以千计的克隆才能获得稳定高表达株系，极大增加了时间和经济成本。

针对这一瓶颈，奥地利研究团队在《New Biotechnology》发表创新性研究，开发了基于CRISPR/Cas9的基因分步激活工具箱。研究人员设计了一个包含2个GFP-Fc和2个BFP-Fc基因的整合表达盒，其中三个基因初始被特异性阻遏元件（Rep）沉默。通过时序性递送靶向不同阻遏元件的gRNA，实现了基因拷贝的精准激活。该研究首次证实：相较于传统全基因激活（All-in）方式，分步激活策略可使CHO细胞获得高达70倍的mRNA表达提升，最终Fc融合蛋白效价提高近10倍。

关键技术方法包括：1）PhiC31整合酶介导的单拷贝稳定整合；2）CRISPR/Cas9系统递送特异性gRNA实现基因时序激活；3）流式细胞分选（FACS）按荧光信号分离激活群体；4）Octet生物层干涉技术定量分泌蛋白；5）qPCR动态监测转录水平变化。实验采用CHO-K1 Hy细胞系，通过三组独立亚克隆（1B2、3D6、4E2）验证策略普适性。

【分子构建设计】
研究人员构建了包含交替排列的GFP-Fc和BFP-Fc基因的表达盒，每个基因配备独特的gRNA靶位点。初始状态下仅1个BFP-Fc基因活跃（1-BFP），其余通过SV40 poly(A)阻遏元件沉默。这种设计允许通过不同gRNA实现基因的特异性激活，同时利用不同荧光蛋白实现激活事件的追踪。

【生产特性分析】
在最终激活四基因（2BFP-2GFP）的细胞中，mRNA水平出现超线性增长：All-in对照组仅达预期4倍（26倍vs单拷贝），而分步激活组最高达70倍。流式检测显示，分步激活组的荧光强度中位数（MFI）比对照组高0.5-1个数量级，且细胞内蛋白积累与分泌效率呈现显著正相关（R²
=0.82）。

【表达调控机制】
研究发现两个关键现象：1）激活新基因会导致已激活基因表达暂时下调，提示细胞存在全局转录资源再分配机制；2）1B2亚克隆系在激活第四基因后仍保持效价增长，而其他克隆达到平台期，揭示不同克隆存在差异化的适应潜力。通过比较发现，分步激活策略使高产克隆出现频率从25%（All-in）提升至75%。

这项研究的重要意义在于：首次在工业化相关场景下证实，哺乳动物细胞可通过表观遗传重编程逐步适应高蛋白合成负荷。分步激活策略模拟了自然进化过程，使细胞有时间调整转录机器、内质网（ER）折叠能力和分泌途径等关键环节。该技术不仅可将稳定细胞株开发周期缩短60%，其揭示的"转录资源竞争"现象为理解CHO细胞表达调控提供了新视角。未来结合基因组安全港（safe harbor）靶向整合技术，有望建立更高效、更稳定的下一代蛋白生产平台。