逆向代谢工程提升酿酒酵母谷胱甘肽产量的新策略及关键基因发现

本研究针对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)谷胱甘肽(GSH)生产效率低的问题，通过逆向代谢工程策略，结合丙烯醛抗性筛选和全基因组测序，鉴定出SSD1(翻译抑制因子)和YBL100W-B(Ty2逆转录转座子)两个关键基因。过表达YBL100W-B使菌株生物量和GSH浓度分别提升1.6倍和2.1倍，为微生物合成高价值化合物提供了新思路。

　　

谷胱甘肽(γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，GSH)是一种具有广泛生理功能的活性三肽，在抗氧化、重金属解毒和免疫调节中发挥关键作用。随着食品、医药和化妆品行业需求激增，全球年产量已超200吨。目前工业生产主要依赖酿酒酵母发酵，但其产量(最高3.2 g/L)远低于大肠杆菌系统(15.2 g/L)。传统代谢工程局限于已知GSH合成途径(GSH1/GSH2)的改造，而逆向代谢工程通过表型驱动筛选可能发现新的调控靶点。

为解决这一瓶颈，研究人员开展了基于丙烯醛抗性的逆向代谢工程研究。前期研究发现GSH含量与丙烯醛抗性正相关，但适应性实验室进化(ALE)策略因其他抗性机制干扰而失效。为此，研究团队创新性地采用两轮紫外线诱变结合丙烯醛抗性筛选：首轮从1140个突变体中筛选出GSH含量提升21%的#ACR3菌株；次轮从1128个衍生突变体中获得GSH含量再增44%的#ACR3-12菌株。全基因组测序发现该菌株存在SSD1(N271D/K1143S)、YBL100W-B(S531P)等7个错义突变。

关键技术包括：(1) 96孔板高通量丙烯醛抗性筛选；(2) Illumina HiSeq 4000全基因组测序；(3) CRISPR/Cas9系统构建单核苷酸多态性(SNP)菌株；(4) HPLC定量GSH/GSSG。

【3.1 丙烯醛抗性筛选提升GSH产量】
通过两轮筛选获得GSH含量1.8倍于野生型的#ACR3-12菌株，验证了丙烯醛抗性与GSH含量的正相关性。相较传统ALE策略，定向筛选有效规避了其他抗性机制的干扰。

【3.2 GSH增产相关基因鉴定】
基因组分析揭示7个编码区SNP，其中SSD1_SNP1*(N271D)和YBL100W-B*(S531P)分别使GSH含量提升20%和24%。SSD1作为细胞壁蛋白翻译抑制因子，可能调控GSH转运蛋白表达；YBL100W-B作为Ty2逆转录转座子，可能通过转座激活相关通路。

【3.3 SSD1与YBL100W-B功能验证】
过表达YBL100W-B使菌体干重和GSH浓度分别达野生型的1.9倍和1.7倍，证实该转座子通过未知机制协同促进细胞生长与GSH合成。而SSD1敲除或过表达均导致GSH下降，说明其N271D突变可能精确调控了特定靶标。

该研究首次将Ty2逆转录转座子应用于代谢工程，为微生物细胞工厂构建提供了新工具。YBL100W-B过表达菌株的显著生长优势，暗示转座可能解除了某些生长限制因子的抑制。结合团队前期开发的GshF双功能酶系统，该发现有望将GSH产量突破至新高度。论文发表于《New Biotechnology》，为天然产物生物合成提供了"表型驱动-机制解析-定向改造"的研究范式。