CRISPR-Cas9基因编辑技术优化人调节性T细胞(SRC-3 KO hTregs)生产工艺：肿瘤免疫治疗新策略

为解决实体瘤免疫抑制微环境中调节性T细胞(Tregs)功能调控难题，研究人员通过CRISPR-Cas9技术靶向敲除SRC-3基因，开发出高效、低脱靶的hTregs编辑工艺。该研究优化了sgRNA选择策略（优先选用sgRNA3），建立四步法生产流程（Protocol 2），实现25-40倍扩增，并通过GUIDEseq/PEM-Seq验证基因组安全性，为Tregs在癌症免疫治疗中的临床转化提供标准化方案。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）一直扮演着"双面角色"——它们既是维持免疫耐受的守护者，又是帮助肿瘤逃避免疫监视的"帮凶"。传统观点认为，Tregs通过抑制效应T细胞功能促进肿瘤进展，这使得Tregs成为癌症治疗的重要靶点。然而，美国贝勒医学院的研究团队另辟蹊径，发现通过基因编辑技术改变Tregs功能可将其从"免疫抑制剂"转变为"免疫激活剂"。他们前期研究显示，特异性敲除Tregs中的类固醇受体共激活因子3（Steroid Receptor Coactivator 3, SRC-3）能重塑肿瘤微环境，在小鼠模型中成功清除三阴性乳腺癌和前列腺癌。这一突破性发现催生了本研究：如何将实验室阶段的基因编辑技术转化为可临床应用的标准化生产工艺？

研究人员采用CRISPR-Cas9基因编辑系统，通过四种不同实验方案对比，结合双轨测序技术（GUIDEseq和PEM-Seq）评估基因组安全性，最终建立从白细胞分离、基因编辑到大规模扩增的完整工艺流程。研究特别关注三个核心问题：如何平衡编辑效率与安全性？哪种生产流程最适合临床转化？冻存工艺是否影响细胞治疗效果？

关键技术方法包括：从健康供体白细胞分离CD4⁺
CD25⁺
T细胞；设计靶向NCOA3基因（编码SRC-3蛋白）的四种sgRNA；通过核转染递送RNP复合物；使用G-Rex气体通透式生物反应器实现大规模扩增；采用GUIDEseq检测脱靶双链断裂，PEM-Seq分析染色体结构变异；通过流式细胞术监测FOXP3表达和细胞活力。

研究结果部分呈现了系统性优化过程：

1. sgRNA选择：在Jurkat细胞中筛选出靶向NCOA3第11/12外显子的sgRNA3和sgRNA4。虽然sgRNA4编辑效率更高（87.1% vs 63.8%），但sgRNA3展现出更优的安全性——96%的测序读数为靶向编辑，仅检测到7个脱靶位点（均不在外显子区），而sgRNA4存在29个脱靶位点且涉及癌基因ADAM9内含子。PEM-Seq进一步证实sgRNA3诱导的染色体易位更少（2 vs 5个），且无持续存在的"热点"区域。

2. 工艺优化：对比四种生产流程发现，Protocol 2（分离后立即核转染→TCR刺激→扩增）最具临床转化价值。该方案在14天内实现7-8倍扩增，保持70%的FOXP3⁺
   细胞比例，且Cas9残留量<1 fg/细胞。关键改进包括：省略CD127分选提高细胞得率；添加雷帕霉素（100 nM）维持Tregs纯度；证实IL-2依赖性可避免治疗后的过度增殖风险。

3. 规模化与冻存：采用G-Rex生物反应器使细胞扩增提升至25-40倍。冻存实验显示，短期（1周）保存对细胞活力和FOXP3表达影响轻微（下降<10%），但长期（6周）冻存会导致FOXP3⁺
   比例降至50%。通过延长恢复期（3天刺激+3天静息）可部分逆转表型丢失。

在讨论部分，作者强调了这项研究的双重意义：方法学上，建立了一套适用于临床级生产的Tregs基因编辑标准，其特色在于将正交测序技术（orthogonal sequencing）纳入质量控制体系；生物学上，证实SRC-3 KO可使hTregs获得促炎特性（IFNγ分泌增加），为"转化型Tregs"治疗实体瘤提供直接证据。与常规免疫检查点抑制剂不同，这种策略不是单纯阻断抑制信号，而是主动将免疫抑制细胞重编程为抗肿瘤免疫的"催化剂"。

该研究的局限性在于未评估TSDR（Treg特异性去甲基化区域）的表观遗传稳定性，且长期冻存产品的功能恢复仍需优化。未来方向包括：采用高保真Cas9变体进一步提高安全性；探索IL-7/IL-15对扩增效应的调控；开展临床级生产验证。这项发表在《Molecular Immunology》的工作，为基于基因编辑的细胞治疗产品开发提供了从靶点选择到工艺放大的完整范式。