基于DNA三角棱柱纳米结构与CRISPR/Cas12a的电化学生物传感器实现甲胎蛋白和miRNA 122的双重检测

针对肝癌早期诊断中多标志物联合检测的难题，研究人员开发了一种基于DNA三角棱柱（DTP）纳米框架与CRISPR/Cas12a系统的电化学生物传感器，结合DNAzyme-HCR三重信号放大策略，实现了甲胎蛋白（AFP）和miRNA 122的高灵敏度检测。该传感器通过非特异性切割作用降低背景信号，检测限低至fM级别，临床样本验证显示其能有效区分健康人与肝癌患者，为肝癌诊断提供了新型多功能平台。

　　

肝癌是全球癌症相关死亡的第四大原因，其中肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的75%-85%。早期诊断对提高患者生存率至关重要，但现有临床手段如影像学检查和肝活检存在成本高、侵入性强等局限。尽管甲胎蛋白（AFP）是常用血清标志物，但其单一检测假阳性率高；microRNA 122虽在HCC中表达显著降低，但传统检测方法如qPCR操作复杂。如何实现多标志物联合检测并提升灵敏度，成为突破临床瓶颈的关键。

四川大学的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》发表研究，构建了一种基于DNA三角棱柱（DTP）纳米结构和CRISPR/Cas12a系统的电化学生物传感器。该平台整合DNAzyme、杂交链式反应（HCR）与CRISPR/Cas12a三重放大策略，首次实现AFP和miRNA 122的双重检测。临床验证表明，其检测限分别达33 aM（miRNA 122）和0.33 pg/mL（AFP），并能有效区分健康人与HCC患者血清样本。

关键技术包括：1）DTP纳米框架的一步法自组装，提供稳定三维支撑界面；2）Mg²⁺
依赖性DNAzyme触发HCR级联反应；3）CRISPR/Cas12a对ssDNA的非特异性切割（trans-cleavage）实现信号转换；4）G-四链体（G4）/hemin复合物电化学信号输出。

研究结果

1. DTP纳米结构的制备与表征
   通过TM缓冲液中三条ssDNA（T1-T3）的一步退火自组装形成DTP，原子力显微镜显示其高度约4 nm，刚性结构可减少非特异性吸附，其顶部ssDNA设计为G4/hemin信号单元锚定位点。

2. DNAzyme-HCR-CRISPR/Cas12a级联放大机制
   靶标存在时释放Mg²⁺
   依赖性DNAzyme（S4），切割发夹DNA（H1）产生触发链C2启动HCR，长链HCR产物激活Cas12a对S6和DTP顶部ssDNA的非特异性切割，使G4/hemin复合物形成受阻，电流信号降低70%（vs空白）。

3. 检测性能优化
   在0.1 M PBS（pH 7.4）含5 mM [Fe(CN)₆
   ]^3?/4?
   的体系中，差分脉冲伏安法（DPV）显示AFP和miRNA 122的线性范围跨越5个数量级，检测限比ELISA低100倍。交叉实验证实其对非靶标分子（如miRNA 21）无响应。

4. 临床样本验证
   检测50例HCC患者和30例健康人血清，ROC曲线下面积（AUC）达0.98（AFP）和0.96（miRNA 122），与qPCR结果一致性达93%。

结论与意义
该研究通过DTP纳米框架的精确空间排布与CRISPR/Cas12a的高效切割能力，解决了传统传感器对核酸/蛋白标志物同步检测的兼容性问题。其创新性体现在：1）DTP有序结构提升CRISPR系统对ssDNA的切割效率；2）单一平台通过简单序列替换即可切换检测靶标；3）无需标记步骤降低检测成本。这种模块化设计为肝癌早诊提供了新范式，并可扩展至其他疾病标志物检测领域。Xuemei Zhang团队指出，未来通过集成微流控技术有望实现床边检测（POCT）应用。