重组杂交体揭示植物病原黑穗菌基因调控、致病机制与肿瘤发生的分子奥秘

本研究通过构建玉米黑穗病菌(Ustilago maydis)与丝黑穗病菌(Sporisorium reilianum)的重组杂交体(rUSH)，系统解析了两种亲缘相近但致病表型迥异的真菌在效应蛋白表达调控和致病机制上的差异。研究创新性地利用CRISPR-Cas9技术构建携带S. reilianum交配型位点的U. maydis重组菌株，通过比较转录组学鉴定出253个差异表达的效应蛋白同源基因，发现其表达受顺式(cis)、反式(trans)及rUSH特异性调控。研究首次证实转录因子UmHdp2是调控U. maydis诱导玉米肿瘤形成的关键调节因子，并鉴定出多个新型毒力因子。该成果为理解真菌-植物互作提供了重要理论依据。

　　

重组杂交体的构建与表征
研究团队通过两步连续的CRISPR-Cas9介导的同源重组技术，将U. maydis单倍体野生型菌株FB1的交配型位点Uma1和Umb1替换为S. reilianum的Sra1和Srb1，成功构建了重组菌株FB1_Sra1b1。该菌株与S. reilianum的相容交配伴侣SRZ2(Sra2b2)杂交后，形成了具有活性的重组U. maydis×S. reilianum杂交体(rUSH)。通过荧光标记技术证实rUSH能够形成双核菌丝，并在感染玉米叶片2天后仍保持稳定的双核状态。值得注意的是，rUSH表现出S. reilianum样的系统感染表型，但缺乏冬孢子形成能力。

rUSH的致病特性分析
比较病理学研究表明，rUSH在玉米幼苗感染6天后诱导产生褪绿和坏死斑点，与S. reilianum的表型相似但程度较轻。在7周龄玉米植株中，部分感染rUSH的植株表现出多雌花序和顶端优势丧失等S. reilianum典型症状。真菌生物量定量分析显示，rUSH在感染3-6天期间生物量显著增加，表明其能够在寄主组织中有效增殖。转录组分析发现，rUSH中119个U. maydis和294个S. reilianum效应蛋白同源基因显著诱导表达，这可能是其维持生物营养互作的关键。

效应蛋白同源基因的表达调控机制
研究团队通过比较转录组学鉴定了253个差异表达的效应蛋白同源基因，并根据表达模式将其分为三类：84个受顺式(cis)调控的基因、61个受反式(trans)调控的基因以及108个呈现rUSH特异性表达的基因。其中，rUSH特异性表达又可分为反向表达(58个)和同源基因特异性表达(50个)两种亚型。通过启动子替换实验证实，效应基因Umtin2的表达差异主要由其启动子区的顺式调控元件决定。值得注意的是，RNA干扰机制并不参与U. maydis同源基因在rUSH中的表达抑制。

新型毒力因子的鉴定
研究筛选出14个在U. maydis野生型中表达量比rUSH高至少5倍的效应蛋白候选基因。通过CRISPR-Cas9构建的UMAG_05312和UMAG_10553基因敲除突变体在玉米感染实验中表现出显著的肿瘤形成缺陷，证实了这些基因的毒力功能。另一方面，对S. reilianum效应基因sr16075的敲除也导致其致病性显著降低。这些发现表明，rUSH特异性表达的效应蛋白同源基因编码了两种病原菌的新型毒力因子。

Hdp2转录因子的关键调控作用
研究发现，在rUSH中过表达U. maydis转录因子Umhdp2能够诱导玉米叶片局部肿瘤形成，这与U. maydis的典型致病表型一致。转录组分析显示，UmHdp2上调了41个U. maydis效应基因的表达，其中包括位于19A和6A效应基因簇的18个基因。同时，玉米中有1,145个基因在rUSH_OE_Umhdp2中显著上调，这些基因主要富集于代谢/分解代谢过程和细胞周期调控等通路。特别值得注意的是，叶片发育标记基因ZmGIF1和ZmSHR1的表达也被UmHdp2激活，这可能是U. maydis诱导肿瘤形成的关键环节。

研究意义与展望
该研究通过构建重组杂交体rUSH，系统解析了两种亲缘相近但致病表型迥异的黑穗菌在基因表达调控和致病机制上的差异。研究不仅鉴定出多个新型毒力因子，还首次明确了UmHdp2转录因子在调控肿瘤形成相关效应基因表达中的核心作用。这些发现为理解真菌-植物互作的分子机制提供了重要线索，也为开发新型病害防控策略奠定了理论基础。未来研究可进一步探索rUSH中冬孢子形成受阻的分子机制，以及UmHdp2调控网络在肿瘤发生中的精确作用机制。