基于聚胺修饰温敏水凝胶的CRISPR/Cas9介导黑色素瘤基因治疗经皮递送系统研究

本研究针对CRISPR/Cas9系统临床应用面临的脱靶效应和递送效率低等难题，开发了三种不同电特性的原位注射水凝胶。通过体内外实验验证，带正电荷水凝胶（Psh）具有更高的细胞摄取率、更强的基因编辑效率和抗肿瘤效果。研究人员设计靶向YB-1基因的sgRNA，与Cas9蛋白形成核糖核蛋白复合物（RNP），并与阿霉素（DOX）共载于Psh中构建协同递送系统。该研究为黑色素瘤的基因-化疗联合治疗提供了新策略，相关成果发表于《Journal of Nanobiotechnology》。

　　

基因编辑技术CRISPR/Cas9被誉为"基因剪刀"，为癌症治疗带来了革命性希望，但其临床应用却面临两大"拦路虎"：一是容易误伤正常基因的脱靶效应，二是难以高效递送至靶细胞。特别是在恶性黑色素瘤治疗中，传统手术切除对转移病灶束手无策，化疗药物又存在全身毒性。如何实现精准、安全的局部基因治疗，成为摆在科学家面前的重大挑战。

湖北大学的研究团队独辟蹊径，将目光聚焦于温敏水凝胶这一"智能载体"。他们创新性地开发了三种电特性各异的水凝胶：中性（Nuh）、负电（Ngh）和正电（Psh）。通过系统比较发现，聚胺修饰的Psh如同配备了"导航系统"，不仅能高效装载CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）和化疗药物阿霉素（DOX），还能在肿瘤部位形成长效"药物仓库"。研究团队特别设计了靶向YB-1基因的向导RNA（sgRNA），该基因被证实是黑色素瘤生长转移的"关键开关"。相关突破性成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上。

关键技术包括：聚胺材料的合成与表征、温敏水凝胶的制备与电特性调控、CRISPR/Cas9 RNP复合物的构建与活性验证、YB-1基因编辑效率的T7核酸内切酶I（T7EI）检测、黑色素瘤小鼠模型的建立与药效评价等。实验采用B16F10黑色素瘤细胞系和C57BL/6小鼠模型。

制备不同电特性的水凝胶
研究团队首先合成了具有正电特性的聚胺材料，通过核磁共振氢谱（¹
H-NMR）验证结构。将聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯（PEO-PPO-PEO）三嵌段共聚物泊洛沙姆407（P407）和188（P188）按特定比例混合制备中性水凝胶（Nuh），再分别添加聚胺或透明质酸（HA）获得正电（Psh）和负电（Ngh）水凝胶。扫描电镜显示Psh具有致密的多孔结构，温度升高时能从液态转变为固态凝胶。

体外递送效率比较
通过荧光标记实验发现，Psh组细胞对DiD（模拟DOX）和FITC-BSA（模拟Cas9）的摄取率高达53.5%，是Ngh组的3倍。凝胶阻滞实验证实Psh对RNP的包封率达91%，显著高于其他组。MTT实验显示Psh@DOX@RNP对B16F10细胞的抑制率（33.28%）远超单独给药组，活死细胞染色进一步验证其协同杀伤效果。

基因编辑效率验证
针对YB-1基因设计的三条sgRNA中，sgRNA-2显示出最强切割活性。T7EI检测显示Psh@RNP处理的细胞中YB-1基因突变频率达53%，qPCR证实YB-1 mRNA水平显著降低。在稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的293T细胞中，Psh@RNP(GFP)使67%细胞失去荧光，证明其高效基因敲除能力。划痕实验表明Psh@DOX@RNP能抑制90%的肿瘤细胞迁移。

体内抗肿瘤效果
黑色素瘤模型小鼠经Psh@DOX@RNP治疗后，肿瘤生长抑制率达98.4%，显著优于游离药物组。免疫组化显示治疗组YB-1和P53蛋白表达降低，Ki67阳性细胞减少，TUNEL检测到广泛凋亡。值得注意的是，T7EI检测证实治疗未在心脏、肝脏等重要器官引起基因编辑，血液学指标和H&E染色均显示良好安全性。

这项研究开创性地将温敏水凝胶的电特性调控与CRISPR/Cas9递送相结合，解决了基因编辑工具体内递送的瓶颈问题。通过YB-1基因靶向编辑与化疗的协同作用，不仅显著增强了黑色素瘤治疗效果，还降低了传统化疗的毒副作用。聚胺修饰的正电水凝胶展现出优异的药物控释性能和肿瘤靶向性，为局部基因-化疗联合治疗提供了新型平台技术。该策略可拓展应用于其他表面肿瘤治疗，具有重要的临床转化价值。