光学混合筛选技术揭示端粒替代延长(ALT)通路调控因子的创新研究

研究人员针对10-15%人类癌症依赖的端粒替代延长(ALT)通路机制不明的问题，开发了结合CRISPR筛选与端粒原生DNA荧光原位杂交(nFISH)的光学混合筛选(OPS)新技术，成功鉴定出FANCM、BLM等关键调控基因，为ALT阳性肿瘤治疗靶点发现提供了高通量研究范式。

　　

在癌症研究领域，端粒维持机制是肿瘤细胞获得无限增殖能力的核心特征。约85-90%的肿瘤通过激活端粒酶(TERT)实现端粒延长，而剩余10-15%的肿瘤（尤其骨肉瘤等侵袭性癌症）则依赖神秘的端粒替代延长(Alternative Lengthening of Telomeres, ALT)通路。这种基于同源重组的机制虽在1997年就被发现，但其分子调控网络仍如"黑箱"，严重阻碍了靶向治疗开发。传统阵列式筛选方法存在通量低、扰动类型有限等瓶颈，而新兴的光学混合筛选(Optical Pooled Screening, OPS)技术虽已应用于多种荧光检测，却从未与能特异性标记ALT活性的端粒原生DNA荧光原位杂交(native DNA FISH, nFISH)技术联用。

美国国家癌症研究所的科研团队在《Methods》发表创新研究，通过巧妙改造实验流程，首次实现OPS与nFISH的兼容整合，建立了可高通量解析ALT通路调控因子的OPS-nFISH技术平台。研究团队首先优化nFISH的杂交条件以适配后续原位测序(ISS)，随后在表达Cas9的ALT阳性细胞系U2OS中开展全基因组CRISPR筛选，通过定量分析单细胞水平的端粒ssDNA信号变化，成功验证了FANCM和BLM基因敲除对ALT活性的调控作用。

关键技术方法包括：1）建立兼容ISS的改良nFISH流程；2）使用含条形码的慢病毒文库在U2OS-Cas9等细胞系中进行低MOI转导；3）通过自动化成像定量单细胞端粒信号；4）应用NIH HPC Biowulf超算进行数据分析。

【Implementation and optimization of optical pooled screens (OPS)】
研究团队在hTERT-RPE1-Cas9、HCT116-Cas9和U2OS-Cas9三种细胞系中测试了OPS基础流程，通过靶向LMNA基因的sgRNA验证了系统灵敏度。特别优化了蛋白酶K消化时间、杂交温度等nFISH关键参数，使端粒信号检测效率提升3倍而不影响后续ISS。

【Discussion】
该研究突破性地将DNA FISH纳入OPS技术体系，首次实现ALT活性的单细胞水平定量筛选。数据显示，在中央神经系统肿瘤中ALT阳性率高达16-65%，凸显该技术的临床价值。优化后的nFISH方案能稳定检测到FANCM/BLM敲除导致的端粒ssDNA变化，证实了平台可靠性。

结论部分强调，OPS-nFISH技术克服了传统阵列筛选的通量限制，可系统评估CRISPR敲除、干扰、激活等多种遗传扰动对ALT的影响。这不仅为解析ALT分子机制开辟新途径，更为开发选择性靶向ALT阳性肿瘤的"合成致死"策略提供了强大工具平台。研究团队特别指出，该技术可拓展应用于其他DNA修复相关通路研究，具有广泛的癌症基因组学应用前景。