CRISPR/Cas9切口酶介导的串联配对切口(TPN)实现精准靶向敲入的分子特征与优化研究

本研究针对CRISPR/Cas9介导的靶向敲入技术中存在的非预期插入缺失(indels)和p53介导的DNA损伤响应问题，通过系统评估串联配对切口(TPN)技术中基因组切口与供体切口的作用机制，证实基因组切口对HDR效率的关键影响，并验证TPN相比传统Cas9核酸酶方案显著降低indels发生率（<6%），为临床和工业应用提供了更精准的基因组编辑策略。

　　

基因组编辑技术的精准性一直是制约其临床应用的关键瓶颈。尽管CRISPR/Cas9系统已实现程序化DNA修饰，但传统双链断裂(DSB)介导的靶向敲入常伴随高达94%的非预期插入缺失(indels)，并激活p53肿瘤抑制通路。日本学术振兴会(JSPS)资助的研究团队在《Methods》发表论文，通过优化Cas9切口酶(nickase)介导的串联配对切口(TPN)技术，揭示了单链切口在提升同源定向修复(HDR)效率中的分子机制。

研究采用KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR扩增、PacBio长读长测序等技术，对比分析HCT116-mutPIGA
细胞系中不同切口配置对敲入效率的影响。

主要发现

1. 质粒载体优于RNP递送系统
   在HCT116-mutPIGA
   模型中，质粒递送Cas9切口酶使靶向碱基替换效率达RNP复合物的2.3倍，证实质粒更适合大片段DNA敲入。

2. 基因组切口的主导作用
   通过修饰标准TPN的双切口配置发现，基因组切口贡献了78%的HDR效率提升，而供体切口仅起辅助作用。额外增加切口数量未能进一步提高效率。

3. 技术方案等效性验证
   TPN与单切口酶方案在PIGA
   和HPRT1
   位点的敲入效率相当（p>0.05），但TPN的indels发生率仅为传统Cas9核酸酶方案的1/16。

4. 长读长测序揭示indels特征
   PacBio数据显示TPN产生的缺失片段90%短于50bp，且大片段缺失（>100bp）频率较DSB方案降低8.7倍，证实其基因组保护优势。

结论与展望
该研究阐明TPN通过精准控制单链切口位置，将p53信号通路激活抑制在基线水平，同时维持与DSB相当的HDR效率。特别值得注意的是，标准双切口配置已达到效率阈值，为临床级基因治疗提供了可预测的编辑窗口。日本学术振兴会与武田科学基金资助的后续研究，将重点优化TPN在诱导多能干细胞(iPSC)等治疗相关细胞中的应用参数。