靶向N-糖基化机制提升构巢曲霉重组蛋白分泌效率的研究

本研究针对丝状真菌重组蛋白分泌效率低的问题，通过CRISPR/Cas9技术敲除构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中14个N-糖基化(algC/algI等)和ERQC(内质网质量控制)相关基因，发现双敲除algC和algI可显著提高GH3 β-木糖苷酶(BxlB)分泌量，同时减少背景蛋白分泌。该成果为工业酶生产提供了新策略，发表于《Metabolic Engineering Communications》。

　　

在生物技术领域，丝状真菌作为"细胞工厂"被广泛用于工业酶生产，但其重组蛋白分泌效率低、成本高的瓶颈问题长期存在。其中，蛋白质翻译后修饰尤其是N-糖基化(N-glycosylation)过程对蛋白稳定性、分泌效率和功能具有关键影响。N-糖基化通过将糖链连接到天冬酰胺(Asn)残基上，参与蛋白质折叠、质量控制等多个环节，但如何通过调控这一通路提升目标蛋白产量仍缺乏系统研究。

针对这一科学问题，国内研究团队在《Metabolic Engineering Communications》发表重要成果。研究人员选择模式菌株构巢曲霉(Aspergillus nidulans)为研究对象，聚焦N-糖基化通路中14个关键基因（包括细胞质区AN5888等6个基因、内质网腔区algC等4个基因、高尔基体AN5748及ERQC相关clxA等3个基因），采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建单敲除和组合敲除突变株。通过整合GH3家族β-木糖苷酶编码基因bxlb作为报告基因，结合表型分析、酶动力学测定、蛋白质组学和分子动力学模拟(MDS)等多学科方法，系统评估了糖基化修饰对重组蛋白分泌的影响。

关键技术方法包括：1) CRISPR/Cas9介导的多基因敲除；2) 基于质谱(LC-MS/MS)的分泌组分析；3) 酶动力学参数(K_m
/V_max
)测定；4) 分子动力学模拟预测糖链-钙联蛋白(calnexin)相互作用；5) 表型分析结合应激实验评估突变株生长特性。

研究结果揭示：

1. N-糖链合成早期基因对真菌生长至关重要
   成功构建8个单敲除突变株，发现AN6874(编码α-1,3/α-1,6-甘露糖转移酶Alg2)和AN7425(寡糖脂翻转酶)敲除导致菌株生长严重缺陷，表明这些基因在基础生理过程中不可或缺。

2. 单基因敲除对蛋白分泌影响有限
   ΔalgC、ΔalgI等单突变株的BxlB分泌量与野生型相当，但48小时培养时酶活性降低，提示糖链缩短可能暂时影响酶构象稳定性。Western blot显示突变株BxlB条带更小(约82 kDa)，证实糖链修饰改变。

3. 双敲除策略显著提升分泌效率
   ΔalgC/ΔalgI双突变株的BxlB分泌量提高1.5倍，比活性增加，且动力学参数(K_m
   =0.62 mM)优于野生型(0.97 mM)。分子动力学模拟揭示其糖链(Glc₁
   Man₅
   GlcNAc₂
   )与钙联蛋白结合时间延长至250 ns，可能通过调控ERQC提高分泌效率。

4. 三敲除影响催化效率
   ΔalgC/ΔalgF/ΔalgI三突变株虽保持分泌水平，但催化效率(K_cat
   /K_m
   )降低25%，MDS显示其糖链(Man₅
   GlcNAc₂
   )因缺失葡萄糖而几乎不与钙联蛋白结合(15 ns)，证实Glc对酶折叠的关键作用。

5. 分泌组重塑助力工业应用
   质谱分析发现突变株分泌组中碳水化合物活性酶(CAZymes)总量减少，但特定GH3、GH7等酶类上调。这种"减量提质"的特性可简化下游纯化流程，具有重要应用价值。

该研究首次系统证明：通过精准调控N-糖基化通路（特别是algC/algI双敲除）可优化丝状真菌蛋白分泌体系，其机制涉及ERQC系统重编程和分泌组选择性重塑。这不仅为工业酶生产提供了新思路——通过减少背景蛋白分泌提升目标蛋白得率，还为糖蛋白功能研究建立了创新方法体系。分子动力学模拟与实验数据的相互验证，为理解糖链-分子伴侣相互作用提供了原子层面见解。未来可进一步探索该策略在其他工业菌株和药用蛋白生产中的应用潜力。