综述：确立Halomonas作为工业生物技术底盘：合成生物学工具开发与代谢工程策略的进展

这篇综述系统阐述了Halomonas（盐单胞菌）作为下一代工业生物技术（NGIB）底盘的优势，重点介绍了其耐高盐特性（3-30% NaCl）实现非无菌培养的突破性潜力，以及通过合成生物学工具（如CRISPR/Cas9、启动子库）和代谢工程（如优化PHB和ectoine合成通路）提升其生产性能的策略。文中强调该菌株在生物塑料（PHB、PHBHHx）、高值化合物（ectoine、mevalonate）及废弃物利用方面的工业应用前景，为可持续生物制造提供了新范式。

　　

背景

传统化工生产依赖化石燃料，碳足迹高。工业生物技术利用微生物底盘（如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌）生产化学品，但面临灭菌成本高、淡水消耗大等问题。Halomonas凭借极端嗜盐性（耐受3-30% NaCl）脱颖而出，其高盐环境下的生长特性可显著降低污染风险，实现开放培养。该菌天然高产生物可降解塑料聚羟基丁酸酯（PHB）和渗透保护剂四氢嘧啶（ectoine），成为NGIB的理想候选。

Halomonas作为NGIB底盘

Halomonas广泛分布于盐湖、海洋等高盐环境，分为中度（3-15% NaCl）和极端嗜盐菌（>20% NaCl）。其耐盐机制包括：积累K⁺
平衡渗透压，以及合成ectoine、甜菜碱等相容性溶质。组学研究发现，高盐条件下其鞭毛组装、ABC转运蛋白相关基因上调，而TCA循环基因下调。代表性菌株如H. bluephagenesis TD01，能在海水中非连续发酵生产PHB，效价达64.74 g/L，生产率1.46 g/L/h。

天然产物与底物多样性

野生型Halomonas可高效合成PHB（H. boliviensis LC1达81% CDW）和ectoine（H. elongata DSM2581产12.91 g/L）。此外，其能利用多种废弃物（如小麦麸皮、咖啡渣）为碳源，H. halophila甚至可转化木质纤维素水解液。但需注意抑制剂（如阿魏酸）可能抑制生长，需通过预处理去除。

遗传操作工具开发

DNA递送：传统电转效率低（仅10³
转化子/μg DNA），RP4接合转移仍是主流方法。载体系统：SEVA质粒（如pSEVA321）因广宿主兼容性被广泛应用，pHbPBC载体利用毒素-抗毒素系统实现无抗筛选。基因元件：

• 启动子库：基于外膜孔蛋白启动子P_porin
  构建，活性跨度310倍，结合lac操纵子实现诱导调控。
• T7样系统：噬菌体来源的MmP1/VP4 RNA聚合酶-启动子对展现高正交性。
• 自诱导系统：如P_phaP1*
  通过PhaR反馈调节提升PHB产量13.5%。

基因组编辑：

• CRISPR/Cas9：双质粒系统敲除效率达100%（如zwf基因），但大片段插入（>3 kb）需延长同源臂至1 kb。
• 碱基编辑：CRISPR-BE系统实现多靶点单碱基编辑（效率100%），成功灭活IS1086转座酶。

代谢工程应用

底盘优化：

• 删除非必需基因（如鞭毛簇）提升稳定性，工程化自絮凝菌株简化下游处理。
• 表达Vitreoscilla血红蛋白（VHb）改善氧供，抑制ftsZ获得70倍长菌体。

非天然产物：

• 共聚物：P34HB（79.5 g/L）、PHBHHx（31.62 g/L）改善PHB机械性能。
• 高值化学品：MVA（121 g/L，产率0.42 g/g）、5-氨基戊酸（67.4 g/L）、L-苏氨酸（33 g/L）。
• 多产物联产：H. bluephagenesis同步生产丙烷（116.3 mg/g CDW）和PHB（69% CDW）。

挑战与展望

当前工具开发集中于H. bluephagenesis，需拓展至其他潜力菌株（如H. boliviensis）。盐度对启动子活性、RBS效率的影响尚待研究。产业化方面，中国PhaBuilder已实现万吨级PHB生产，英国C3 Biotechnologies利用Halomonas生产生物燃料，验证了其规模化潜力。未来需结合组学数据深化机制解析，开发更具鲁棒性的工程菌株。