基于CRISPR-Cas13a免疫层析试纸条的多重呼吸道RNA病毒免扩增检测技术开发

为解决呼吸道RNA病毒检测中RT-qPCR操作复杂、胶体金法灵敏度不足的问题，福州疾控中心团队开发了基于CRISPR-Cas13a的"条带消除"式免疫层析试纸条，实现SARS-CoV-2与H3N2流感病毒381.75拷贝/μL的检测限，临床样本验证与RT-qPCR符合率达100%，为现场筛查提供快速低成本方案。

　　

呼吸道病毒感染是全球公共卫生重大威胁，尤其对老年、婴幼儿等高风险人群危害显著。传统实时定量逆转录PCR(RT-qPCR)虽为金标准，但依赖专业设备且耗时长；胶体金试纸条虽便捷却易出现假阴性。在COVID-19大流行背景下（截至2024年全球已造成7.05亿人感染），亟需开发兼具高灵敏度与现场适用性的检测技术。

福州疾控中心联合多家机构的研究团队在《Virology Journal》发表创新成果，将CRISPR-Cas13a系统与胶体碳标记免疫层析技术结合，开发出免核酸扩增的多重病毒检测平台。该技术利用Cas13a的RNA切割活性，通过"条带消除"判读模式（阳性样本检测线消失），实现SARS-CoV-2与H3N2流感病毒同步检测，最低检测限达381.75拷贝/μL，临床验证显示与RT-qPCR结果完全一致。

关键技术方法包括：1）设计靶向SARS-CoV-2的S/N基因和H3N2的M基因的crRNA（CRISPR RNA）；2）建立胶体碳标记的兔抗生物素抗体检测系统；3）采用三线式试纸条布局（T1-T3检测线+C质控线）；4）使用数字PCR(ddPCR)和RT-qPCR定量标准品；5）验证9例SARS-CoV-2临床样本（5阳/4阴）和16例双病毒样本（8例SARS-CoV-2+8例H3N2）。

【多线胶体碳试纸条制备与表征】
通过FAB-11nt-polyU、DB-poly-11nt、TB-11nt-polyU三种探针分别对应T1-T3检测线，验证了多靶标检测可行性。如图2所示，当目标RNA存在时，Cas13a切割探针导致对应检测线消失，成功实现"三靶标-三线判读"的检测逻辑。

【检测特异性与准确性】
对9例灭活临床样本的检测显示（图4），该技术与RT-qPCR和胶体金法结果100%吻合。如图3所示，RT-qPCR的Cq值<35的阳性样本（样本2-6）在试纸条上均显示T线消失，而阴性样本（样本1,7-9）保持T线显色，证明其特异性。

【检测限分析】
通过ddPCR定量标准品（1.219×10⁸
拷贝/μL），梯度稀释实验表明（图5d），381.75拷贝/μL为可靠检测下限。当病毒载量降至190拷贝/μL时出现假阴性，提示需优化探针设计以提高灵敏度。

【双靶标临床样本检测】
在16例双病毒检测中（图6），14例成功检出（87.5%灵敏度），2例假阴性可能源于样本降解或低病毒载量。T1线（SARS-CoV-2）和T2线（H3N2）的独立显色模式证实多重检测可行性，但需避免Cas13a的旁切活性干扰。

该研究开创性地将CRISPR诊断技术与免疫层析平台结合，突破传统方法对核酸扩增的依赖。其创新价值体现在：1）首创"条带消除"判读模式，解决多靶标检测时Cas13a非特异性切割的干扰；2）胶体碳标记相较胶体金成本降低50%以上；3）实现30分钟内完成检测，适用于基层医疗机构。尽管灵敏度仍逊于RT-qPCR，但其操作简便性（仅需恒温装置）和多重检测能力，为呼吸道病毒流行季的快速分型筛查提供新工具。未来通过优化crRNA设计、引入信号放大策略，有望将检测限提升至100拷贝/μL以下，推动CRISPR诊断技术的临床转化。