不对称负载的TnsE调控Tn7转座子靶向DNA复制结构的分子机制

本研究揭示了Tn7转座子靶向DNA复制结构的分子机制。研究人员通过整合结构生物学方法，发现转座子编码蛋白TnsE通过形成不对称的1:1和2:1（TnsE:DNA）复合物识别3'-凹陷DNA结构，其中功能获得型突变体更倾向于形成2:1复合物。该研究阐明了TnsE通过C端结构域结合双链DNA、N端结构域决定底物特异性的分子机制，为理解转座子靶向选择提供了新见解。

　　

在细菌基因组中，转座子如同"基因组跳跃者"，其精准的靶向插入机制对宿主生存和基因水平转移至关重要。Tn7转座子家族以其精密的靶向选择系统著称，能够特异性地插入染色体保守位点或复制中的质粒DNA。然而，尽管Tn7通过TnsD蛋白靶向attTn₇
位点的机制已被深入研究，其通过TnsE蛋白识别DNA复制结构的途径仍知之甚少。这一知识缺口限制了人们对转座子水平传播机制的理解，也阻碍了基于Tn7的基因编辑工具的开发。

为破解这一难题，McGill大学的研究团队采用整合结构生物学方法，揭示了TnsE识别复制位点的分子机制。研究发现TnsE在3'-凹陷DNA上形成1:1和2:1复合物，其中功能获得型突变体更倾向于形成2:1复合物。结构分析表明，TnsE通过C端结构域识别双链DNA，而N端结构域负责底物特异性和转座酶核心机器的招募。这些发现支持了一个新模型：TnsE介导的靶点选择依赖于不对称TnsE:DNA复合物的形成，从而将Tn7转座酶招募到DNA复制结构上。该研究发表于《Nucleic Acids Research》，为理解转座子的靶向机制提供了重要见解。

研究团队运用了多项关键技术：通过X射线晶体学解析了TnsE C端结构域与DNA复合物的结构（分辨率2.8 ?）；采用冷冻电镜（分辨率6.1 ?）和SAXS分析复合物的整体结构；利用天然质谱和沉降速度分析确定复合物化学计量；通过电泳迁移率实验（EMSA）评估DNA结合特性；结合AlphaFold预测进行结构建模。

C端结构域结合双链DNA
晶体结构显示，Thiopseudomonas alkaliphila TnsE的C端结构域（TaTnsE_CTD
）通过对称性形成2:1复合物。虽然结晶过程中蛋白发生蛋白酶解，但实验证实C端结构域足以结合双链DNA，而N端结构域决定底物特异性。

DNA结合稳定V-loop构象
结构比较发现，DNA结合使V-loop（Val⁴⁵¹
-Ser⁴⁶¹
）稳定在单一构象。功能获得型突变体TnsE^AVDN
（A453V/D523N）的V-loop也呈现类似构象，表明该环作为DNA结合开关发挥作用。

TnsE形成1:1和2:1 DNA复合物
溶液分析揭示野生型TnsE形成1:1和2:1复合物，而功能获得型突变体更倾向形成2:1复合物。沉降实验和天然质谱证实这一现象，其中30ss+30ds DNA底物更易诱导2:1复合物形成。

不对称的高阶复合物组装
冷冻电镜显示2:1复合物呈"哑铃"状，晶体结构和AlphaFold预测支持"反平行"结合模式。有趣的是，只有一个N端结构域与单链DNA结合，另一个保持游离状态，提示不对称功能分配。

研究结论与意义
该研究提出了Tn7靶向复制结构的级联模型：β滑动夹通过N端结构域将首个TnsE锚定在复制位点，促进C端结构域结合DNA并协同招募第二个TnsE分子。游离的N端结构域可能重塑DNA单链末端以招募TnsC适配蛋白。这种不对称组装解释了Tn7插入的方向偏好（左-右），与TnsD介导的插入方向相反。

这项工作不仅阐明了Tn7转座子靶向复制结构的分子机制，也为理解其他Tn7家族元件的靶向选择提供了框架。研究发现的两个关键特征——靶点与插入位点的严格间距由复合物组装的最小DNA长度决定，以及靶点特异性受紧凑复合物形成能力影响——可能普遍适用于转座子靶向系统。这些发现对开发基于转座子的基因编辑工具具有重要指导意义。