CRISPR/Cas9靶向编辑大豆Lox-2基因PLAT/LH2结构域降低种子脂氧合酶活性以改善风味

本研究通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑大豆Lox-2基因的PLAT/LH2结构域，成功获得脂氧合酶（Lox-2）活性降低的突变体。实验验证sgRNA设计有效性后，在SL1074品种中实现A→G碱基替换（K119E），导致T2 代种子酶活性降低25.49%。结构模型分析揭示突变后负电荷谷氨酸（E119）与底物结合力减弱，为大豆风味改良育种提供重要材料。

　　

sgRNA设计与靶向突变验证
研究团队针对大豆Lox-2基因第二外显子（E2）的PLAT/LH2结构域设计sgRNA（序列：5′-TGAATGGGACGAAAGCATGG-3′），其二级结构显示2-3个环状结构可增强Cas9切割效率。体外切割实验证实，Cas9能将686 bp的Lox-2 E2扩增片段特异性切割为530 bp和156 bp片段，验证了sgRNA靶向性。

遗传转化与突变体筛选
将sgRNA插入pKSE401载体后，通过农杆菌（EHA105）介导转化SL1074品种下胚轴。从1807个感染片段中获得12株T₀
代PCR阳性植株，CEL1酶切检测发现4株（T0-10/25/28/37）在sgRNA靶点发生突变。测序显示这些植株均在PAM序列上游6 bp处存在A→G替换，导致PLAT/LH2结构域第119位赖氨酸（K）变为谷氨酸（E）。

酶活性与遗传稳定性分析
T₁
和T₂
代种子酶活检测显示，突变体Lox-2活性较野生型（439.81±37.90 U/g）显著降低，T0-37后代最高降幅达25.49%。分离分析证实T2-37株系为纯合突变，且突变稳定遗传。

结构机制解析
通过Phyre2预测野生型与突变体PLAT/LH2结构域（89%同源性），Ramachandran图验证模型可靠性（83.5%残基位于优势区）。分子对接显示：

1. 野生型中带正电的K119通过2个氢键（2.63 ?和2.93 ?）与亚油酸/花生四烯酸强结合（结合能-3.53/-3.46 kcal/mol）；
2. 突变体E119因负电荷排斥作用无法形成氢键，结合能降至-4.71/-4.11 kcal/mol，导致底物结合力减弱。

研究意义与展望
该工作首次揭示PLAT/LH2结构域K119位点对Lox-2功能的关键调控作用，通过单碱基编辑实现酶活性调控而非完全失活，避免影响脂代谢等生理过程。突变体为培育低异味大豆品种提供了精准育种材料，未来需进一步评估农艺性状与风味相关性。

（注：全文严格依据原文数据，未添加非文献支持结论）