CRISPR/Cas9构建Dmd外显子10-17重复大鼠模型揭示杜氏肌营养不良的广泛横纹肌损伤机制

本研究通过CRISPR/Cas9技术首次构建了携带Dmd基因外显子10-17重复突变的Sprague Dawley大鼠模型（R-DMDdup10-17），填补了杜氏肌营养不良（DMD）重复突变动物模型的空白。研究人员发现该模型表现出与人类DMD患者相似的肌纤维坏死、进行性肌肉萎缩及心脏电生理异常，并建立基于胫骨长度立方（TL3 ）的新型数据校正方法。该成果为靶向基因治疗提供了关键临床前工具，发表于《Skeletal Muscle》。

　　

杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种X连锁遗传病，患者因DMD基因突变导致肌营养不良蛋白（Dystrophin）缺失，引发进行性肌肉萎缩和心功能衰竭。尽管约10%的DMD病例由基因重复突变引起，但此前缺乏能准确模拟此类突变的动物模型。现有小鼠模型疾病表型较轻微，而大型动物模型成本高昂且个体差异大。这一空白严重阻碍了针对重复突变的基因治疗研发。

法国巴黎东克雷泰伊大学等机构的研究团队利用CRISPR/Cas9技术在Sprague Dawley大鼠中成功构建了Dmd外显子10-17重复模型（R-DMDdup10-17）。该模型首次再现了人类DMD重复突变的核心特征：6月龄即出现广泛肌纤维坏死、心肌纤维化和运动功能障碍，10月龄后死亡率显著升高。研究还创新性提出以胫骨长度立方（TL³
）替代体重作为数据校正标准，解决了肌萎缩导致的统计偏差。相关成果为精准医疗提供了重要工具，发表于《Skeletal Muscle》。

关键技术方法
研究采用CRISPR/Cas9基因编辑构建外显子10-17重复模型，通过电穿孔技术转染受精卵。功能评估包括：清醒状态握力测试、体内胫骨前肌电刺激、全身体积描记法监测呼吸功能、遥测心电图（ECG）分析心脏电活动。组织学分析采用HE染色定量病理指数、天狼星红染色量化纤维化。血浆生物标志物检测涵盖肌酸激酶（CK）、肌球蛋白-3（MYOM3）和高敏肌钙蛋白T（hs-cTnT）。

研究结果

1. 肌营养不良蛋白缺失与早逝
基因编辑成功引入125 kb重复片段（图1A），导致Dp427亚型翻译提前终止（图1E）。6月龄DMD大鼠血浆CK和MYOM3水平显著升高（图1F-H），10月龄出现心肌损伤标志物hs-cTnT升高（图1I），证实骨骼肌和心肌持续坏死。模型动物中位生存期仅10-13个月（图1D）。

2. 全身性肌肉萎缩
传统体重校正法掩盖了TA肌肉质量下降（图2B），而TL³
校正显示10月龄DMD大鼠TA、EDL、比目鱼肌和心脏质量显著降低（图2C-E）。累积肌肉质量分析揭示6月龄已出现萎缩趋势（表1）。

3. 肢体肌肉组织学与功能损伤
HE染色显示肌纤维形态异常伴随炎症浸润（图3A），病理指数随年龄增长加剧（图3B）。天狼星红染色证实纤维化进展（图3C）。握力测试和直接电刺激均显示肌力下降（图3D-F），力频曲线右移提示兴奋-收缩耦联障碍（图3H）。

4. 自发性运动能力减退
6月龄DMD大鼠在运动场中行进距离和速度降低50%（图4B-C），攀爬成功率归零（图4E），与肌力测试结果高度吻合。

5. 膈肌重构与呼吸缺陷
膈肌病理指数和纤维化进行性加重（图5B-C）。6月龄时峰值吸气流速下降通过延长吸气时间代偿（图5F-G），但10月龄代偿机制失效导致潮气量显著降低（图5H）。

6. 心肌重构与心电异常
左心室出现特征性间质纤维化（图6A-C）。ECG显示DMD大鼠T波切迹（图6D），QTpeak校正间期（QTpc）延长（图6E），提示心室复极化异常。

结论与意义
该研究创建了首个模拟DMD重复突变的哺乳动物模型，其疾病进展轨迹与人类患者高度一致。创新性TL³
校正方法解决了肌萎缩研究中的统计难题，非侵入性功能评估体系（如T波切迹检测）为临床前研究提供了新标准。模型填补了基因重复突变治疗研究的工具空白，特别适用于CRISPR介导的精准基因编辑疗法验证。研究还提示Dp140亚型可能参与神经系统症状，为探索DMD多系统病变机制开辟新方向。