弱保幼激素信号通过调控卵巢转录组导致埃及伊蚊卵子发生缺陷的分子机制研究

本研究针对埃及伊蚊繁殖力下降的分子机制展开深入探索。研究人员通过CRISPR/Cas9构建epoxidase基因敲除突变体（epox-/-），发现弱保幼激素信号（weak JH signaling）导致甲基法尼酯（MF）积累而非JH III合成，进而通过RNA-seq技术系统分析了野生型与突变体在卵子发生四个关键阶段的卵巢转录组差异。研究揭示了230个长链非编码RNA（lncRNA）和大量DNA结合蛋白的异常表达模式，证实了蜕皮激素（ecdysteroid）水平紊乱是造成卵黄膜蛋白（VMP）表达延迟的关键因素。该发现为蚊媒疾病防控提供了新的分子靶点，发表于《BMC Biology》。

　　

蚊媒传染病一直是全球公共卫生的重大威胁，埃及伊蚊作为登革热、寨卡病毒等重要病原体的传播媒介，其繁殖能力直接影响疾病传播效率。保幼激素（Juvenile hormone, JH）作为昆虫发育和繁殖的核心调控因子，其合成通路中的关键酶——甲基法尼酯环氧化酶（epoxidase）的生物学功能尚不完全清楚。当这个酶失活时，昆虫体内会积累甲基法尼酯（methyl farnesoate, MF）而非活性JH III，这种"弱保幼激素信号"现象如何影响蚊虫繁殖力成为亟待解决的科学问题。

捷克科学院寄生虫学研究所联合佛罗里达国际大学的研究团队在《BMC Biology》发表重要成果。研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建epoxidase基因敲除突变体（epox-/-），通过LC-MS/MS检测激素水平，结合四阶段（0h新羽化、4天糖饲喂、16h和48h血餐后）卵巢转录组分析，系统阐明了弱JH信号导致繁殖缺陷的分子机制。研究发现突变体出现显著的卵泡发育延迟，约50%卵泡发生凋亡，产卵量减少一半。转录组数据显示，突变体中230个长链非编码RNA（lncRNAs）和大量含锌指结构域（如Kr-h1基因）的DNA结合蛋白表达异常。特别值得注意的是，蜕皮激素（ecdysteroid）合成延迟直接导致卵黄膜蛋白（VMP15a1-3）等关键基因的表达时序紊乱。

关键技术方法包括：1）利用CRISPR/Cas9构建epoxidase基因敲除的埃及伊蚊Orlando品系突变体；2）采集四个发育阶段（0h、4d SF、16h BF、48h BF）的卵巢组织进行triplicate RNA-seq分析；3）通过HPLC-MS/MS定量检测2-脱氧蜕皮酮（2DOE）、蜕皮酮（E）和20-羟基蜕皮酮（20E）三种蜕皮激素水平；4）采用CPC2和LncDC算法鉴定lncRNAs，结合MEME套件进行motif分析；5）使用CLAPE和DeepTFactor预测DNA结合蛋白与转录因子。

【Epox-/-成年雌性表现出严重卵巢缺陷表型】
通过比较野生型与突变体在四个关键发育阶段的卵巢形态，研究发现新羽化时（0h）两者无差异，但4天糖饲喂后（4d SF），突变体卵泡数量减少50%且发育滞后。血餐后16h（16h BF），突变体卵泡仍未能达到野生型成熟大小（100μm）；至48h血餐后（48h BF），野生型卵泡呈现典型卵圆形而突变体仍保持圆形。这些表型证实弱JH信号严重影响卵子发生进程。

【弱JH信号导致卵巢mRNA表达谱剧变】
RNA-seq分析鉴定出13,014个表达基因，主成分分析显示PC1和PC2分别解释56%和19%的变异。差异表达基因（DEGs）数量随发育阶段递增，48h BF时达峰值（1,239个）。基因集富集分析（PGSEA）显示，突变体中DNA复制、RNA加工、磷脂代谢等通路在4d SF阶段显著抑制，而血餐后生殖相关通路（如卵子发生、胚细胞发育）表达紊乱。

【蜕皮激素调控基因表达显著延迟】
qPCR验证显示，野生型中卵黄膜蛋白基因（VMP15a1-3）在血餐后36h达峰，而突变体延迟至48h。LC-MS/MS检测发现突变体2DOE、E和20E的峰值均滞后6-12h。这种激素时序紊乱直接解释了VMP、气味结合蛋白（OBP）等重要基因的表达延迟现象。

【epoxidase突变改变lncRNAs和DNA结合蛋白表达】
从34,477个预测转录本中鉴定出3,695个高置信度lncRNAs，其中234个在突变体中差异表达。DNA结合蛋白分析发现1,982个含锌指结构域的蛋白发生表达改变，包括关键转录因子Kr-h1（含C2H2结构域）。Fasim-LongTarget预测显示部分lncRNAs可能通过RNA-DNA三链体结构调控Kr-h1等靶基因。

这项研究首次系统阐明了epoxidase缺陷通过弱JH信号影响埃及伊蚊繁殖力的分子机制。甲基法尼酯（MF）不能完全替代JH III的功能，导致蜕皮激素合成延迟和下游基因表达紊乱。发现的230个差异表达lncRNAs和大量异常转录因子为蚊虫生殖调控网络提供了新认知。特别值得注意的是，卵黄膜蛋白等关键生殖基因的表达时序依赖精确的JH-蜕皮激素级联调控，这一发现为开发新型蚊媒控制策略（如通过干扰激素信号阻断繁殖）奠定了理论基础。研究建立的四阶段卵巢转录组数据库将成为后续功能基因组研究的重要资源，相关lncRNAs和DNA结合蛋白的深入解析可能揭示昆虫特有的生殖调控模式。