基于CRISPRi-FnCas12a的模块化信号响应型基因开关在大肠杆菌中的精准转录调控研究

为解决合成生物学中转录调控工具存在的泄露表达和可调性不足等问题，韩国生物科学与生物技术研究院的研究团队开发了一种整合转录因子生物传感器与FnCas12a CRISPR系统的基因开关平台。该研究通过利用FndCas12a的RNase活性直接处理crRNA，结合终止子过滤器技术，实现了对质粒和染色体基因的精准动态调控，并成功应用于代谢通路重编程。该成果为复杂基因电路设计和工业生物技术提供了新型工具，发表于《Journal of Biological Engineering》。

　　

在合成生物学领域，精确而动态的转录调控一直是构建稳健基因电路和可编程细胞系统的关键挑战。传统转录因子(TF)工具虽广泛应用，却常受限于泄露表达、可调性不足等问题，尤其在复杂遗传背景下表现更为突出。与此同时，CRISPR-Cas技术虽已革新基因组编辑领域，但基于dCas9的CRISPR干扰(CRISPRi)系统在细菌中易引发细胞毒性，而dCas12a系统的优化研究仍处于起步阶段。这些技术瓶颈严重制约了合成生物学在代谢工程和生物制造中的应用潜力。

针对这一现状，韩国生物科学与生物技术研究院的Seong Keun Kim、Seung-Gyun Woo等研究人员开展了一项创新性研究。他们巧妙结合TF生物传感器与V-A型FnCas12a CRISPR系统，开发出模块化的CRISPRi基因开关平台。该研究通过利用FndCas12a(D917A突变体)独特的RNase活性，使其能够直接从生物传感器响应的mRNA转录本中加工产生功能性crRNA，实现了信号依赖性的精准基因调控。相关成果已发表在《Journal of Biological Engineering》上，为合成生物学工具箱提供了重要补充。

研究团队主要采用四项关键技术：1) 构建FnCas12a(D917A)突变体的表达系统；2) 设计含终止子过滤器的crRNA表达盒以控制泄露转录；3) 开发基于L-阿拉伯糖(P_BAD
)和IPTG(P_TRC
)诱导的双向调控系统；4) 应用代谢遗传开关动态调控gapA基因并补偿表达gapC基因。实验选用大肠杆菌DH5α作为模式生物，通过微孔板读数仪实时监测荧光报告基因(RFP/GFP)表达和细胞生长(OD₆₀₀
)。

CRISPRi基因开关的建立
研究首先验证了L-阿拉伯糖诱导系统(P_BAD
-rfp-crRNA)对质粒编码gfp的调控效果。结果显示，仅16 μM L-阿拉伯糖即可显著抑制GFP表达，证实FndCas12a能有效加工转录本生成功能性crRNA。相比之下，IPTG诱导系统(P_TRC
)虽能诱导更强RFP表达，但基础泄露较高，导致非诱导状态下GFP仍被部分抑制。

终止子过滤器优化调控精度
为降低强启动子(P_TRC
)的基础转录，团队测试了T9-T378系列终止子。其中T25终止使OFF状态GFP恢复率达77%，动态范围(OFF/ON比)提升至14.7倍。针对染色体整合的gfp基因，双终止子组合T25-T244表现最佳，使OFF状态表达恢复64%，动态范围达10.5倍。

信号放大器的构建
将系统应用于TetR阻遏系统时，含T244终止子的设计使EC₅₀
降至5 nM，较传统系统灵敏度提高10倍。该设计还被成功拓展至吲哚乙酸(IAA)生物传感器，通过靶向iacR基因实现信号放大。

代谢遗传开关的应用
最具突破性的是gapA代谢开关设计。通过PTET启动子驱动gapC基因表达并靶向抑制内源gapA，在维持细胞生长的同时实现了糖酵解通路的动态重编程。aTC诱导下，系统成功将半数生长时间(ET₅₀
)从6.5小时延长至11.3小时，而gapC补偿使生长速率恢复至对照水平。

这项研究建立的CRISPRi基因开关平台，通过整合FndCas12a的RNA处理能力和终止子过滤技术，实现了对基因表达的精准时空控制。其创新性体现在三方面：1) 首次将FnCas12a的RNase活性应用于动态crRNA生产；2) 通过终止子工程系统解决了强启动子泄露难题；3) 开发出无需基因组编辑的代谢通路动态调控策略。该技术不仅为复杂基因电路设计提供了新范式，更在代谢工程领域展现出巨大潜力——通过动态平衡细胞生长与产物合成，有望突破现有生物制造的产量瓶颈。未来，该平台在非模式微生物中的适配性研究，以及与多组学技术的整合应用，或将开启合成生物学精准调控的新纪元。