新型AAV-PHP.S胸腔注射技术特异性标记膈肌传入神经的突破性研究

本研究针对传统方法难以特异性标记膈肌传入神经的技术瓶颈，创新性采用AAV-PHP.S（腺相关病毒PHP.S亚型）胸腔注射技术，成功实现C3-C5背根神经节（DRG）中膈肌传入神经的高效、特异性标记，同时避免运动神经元转导。该技术为呼吸系统感觉神经功能研究提供了非侵入性工具，对解析呼吸调控机制具有重要意义。

　　

呼吸系统的精细调控离不开对感觉神经功能的深入理解，但长期以来，研究者们面临一个棘手难题：如何精准标记支配膈肌的传入神经？这些位于C3-C5背根神经节（DRG）的神经元，不仅负责传递膈肌的运动状态信息，还可能参与呼吸节律的调控。然而，传统方法如鞘内注射、肌肉注射或直接DRG注射，要么手术创伤大，要么会同时标记运动神经元和其他无关的感觉神经，难以实现特异性研究。更麻烦的是，膈肌传入神经与上肢、颈部的感觉神经在DRG中混杂分布，使得选择性标记成为"大海捞针"般的挑战。

针对这一技术瓶颈，Marquette大学的研究团队独辟蹊径，利用一种经过基因工程改造的腺相关病毒AAV-PHP.S（该病毒对感觉神经元具有特殊亲和力），通过非手术的胸腔注射途径，成功实现了膈肌传入神经的特异性标记。这项发表在《Journal of Neuroscience Methods》上的研究，不仅为呼吸神经科学研究提供了重要工具，更为探索呼吸调控机制开辟了新途径。

研究团队主要采用了以下关键技术：胸腔注射AAV-PHP.S-CAG-tdTomato病毒载体（滴度2.2×10¹³
vg/mL）；建立膈神经切断模型验证特异性；免疫荧光染色检测PV（parvalbumin）和NeuN标记；双通道荧光显微成像定量分析；DRG神经元面积和直径计算。所有实验均使用3-4月龄雄性Sprague Dawley大鼠（n=22）。

【结果部分】

1. 新型方法验证：8周后观察到DRG神经元中tdTomato的强烈表达，标记的传入纤维广泛分布于背根、背柱和脊髓灰质，但未见运动神经元标记。膈神经切断后标记减少82%，证实技术特异性。

2. 神经元特征分析：66%的标记神经元共表达PV（一种大直径有髓传入神经标记物），细胞面积>800 μm²
   、直径>30 μm，提示主要标记本体感觉神经元。

3. 时间动态观察：1周即可检测到表达，2周达平台期，8周时脊髓投射纤维标记最为明显。

4. 脊髓投射模式：标记纤维密集分布于楔束，并投射至背角I-IV层、中间灰质V-VII层，部分延伸至腹角邻近膈运动神经元区域，但未形成典型突触结构。

这项研究首次证明，AAV-PHP.S胸腔注射可特异性转导膈肌传入神经而不影响运动神经元，解决了长期困扰领域的技术难题。尤为重要的是，该方法标记的主要是大直径有髓传入神经（多数为PV阳性），这与膈肌中高尔基腱器官和少量肌梭的解剖特点相符。从应用角度看，这种非手术方法可与光遗传学、化学遗传学工具联用，为研究呼吸感觉-运动整合机制提供了全新可能。在神经可塑性研究方面，清晰的脊髓投射图谱（特别是向腹角的延伸）暗示了传入神经可能通过多突触通路影响膈运动神经元活动，这为理解呼吸中枢模式发生器的调控提供了新视角。

从技术发展史来看，该研究标志着AAV载体应用的重要突破：传统AAV9主要靶向中枢神经系统，而经过CREATE技术改造的AAV-PHP.S通过在588-589位点插入7聚体，显著提高了对周围感觉神经元的转导效率。与既往使用的霍乱毒素B亚基（CTB）或辣根过氧化物酶（HRP）相比，病毒载体能实现更完整的神经突起标记，有利于追踪长程投射。研究还发现，虽然单侧注射可导致双侧标记（可能与病毒在膈肌内的扩散有关），但通过膈神经切断实验仍能有效验证标记的特异性，这为后续研究设计提供了重要参考。

这项技术的临床意义同样值得关注。膈肌传入神经异常与多种呼吸系统疾病相关，包括慢性阻塞性肺病、脊髓损伤后呼吸功能障碍等。该方法的建立使得研究者能够更精准地操控特定神经群体，为开发针对性治疗策略奠定了基础。未来研究可进一步探索不同亚型传入神经（如伤害性感受器）的标记条件，以及与其他神经调控技术的整合应用，从而全面揭示呼吸感觉系统在生理和病理过程中的作用机制。