基于BCSP31靶标的RPA-CRISPR/Cas12a快速灵敏检测技术在布鲁氏菌诊断中的应用

本研究针对布鲁氏菌病传统诊断方法（如血清学检测和PCR）在灵敏度、特异性及速度上的局限性，开发了一种整合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a系统的分子检测平台。该技术以布鲁氏菌特异性保守序列BCSP31为靶标，实现了10拷贝/反应的高灵敏度和16.6 attomoles的检测限，临床样本验证显示与qPCR结果高度一致，为布鲁氏菌病的早期诊断和防控提供了高效工具。

　　

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌（Brucella）引起的人畜共患病，对畜牧业和公共卫生构成严重威胁。传统诊断方法如血清学检测无法直接确认病原体，而PCR虽灵敏却依赖昂贵设备和复杂操作。CRISPR-Cas系统的出现为分子诊断带来革命性突破，其中Cas12a因其对单链DNA（ssDNA）的附带切割活性尤为突出。重组酶聚合酶扩增（RPA）技术可在恒温下快速扩增DNA，两者结合为资源有限地区的现场检测提供了新思路。

石河子大学人畜共患病协同创新中心的研究人员开发了一种靶向布鲁氏菌BCSP31基因的RPA-CRISPR/Cas12a检测系统。通过优化RPA引物和CRISPR RNA（crRNA），该系统在37°C下30分钟内完成扩增，并利用Cas12a的荧光信号实现高特异性检测。研究使用布鲁氏菌（B. abortus、B. melitensis等）和非布鲁氏菌（如大肠杆菌、沙门氏菌）基因组DNA验证性能，临床血液样本检测显示其灵敏度显著优于传统玫瑰 Bengal试验（RBT）。

关键方法

1. 设计靶向BCSP31基因的RPA引物和crRNA；
2. 优化RPA-CRISPR/Cas12a反应体系（37°C恒温）；
3. 使用荧光信号检测Cas12a的附带切割活性；
4. 临床样本（84份血液）与qPCR对比验证。

研究结果

• 材料：实验涵盖4种布鲁氏菌标准株及7种非布鲁氏菌病原体，确保检测特异性。
• 系统优化：针对BCSP31基因的95–417 bp和1564–1817 bp区域设计引物，筛选最优组合。
• 讨论：Cas12a的DNA切割能力使其适用于多种样本类型（血液、分泌物等），且RPA的等温特性简化了操作流程。
• 结论：该平台检测限低至10拷贝/反应，临床符合率高，适用于基层推广。

意义
该研究将RPA的快速扩增与CRISPR-Cas12a的高精度结合，突破了传统诊断的技术瓶颈，为布鲁氏菌病的早期防控提供了便携、可靠的解决方案。论文发表于《Journal of Microbiological Methods》，其技术路线可拓展至其他病原体检测领域。