CRISPRi筛选揭示lncRNA在皮肤鳞状细胞癌生长中的关键作用及LINC00704/LINC01116的调控机制

为解决皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中lncRNA功能未知的问题，研究人员通过单细胞测序和CRISPRi筛选，鉴定出294个cSCC特异性lncRNA，并验证LINC00704和LINC01116通过调控细胞周期和分化影响肿瘤生长，为靶向治疗提供新思路。

　　

皮肤鳞状细胞癌(cSCC)是全球第二大高致死率皮肤癌，占皮肤癌死亡病例的20%，其侵袭性导致晚期患者10年生存率不足20%。尽管已知紫外线诱发的NOTCH1、TP53等基因突变驱动cSCC发生，但非编码RNA尤其是长链非编码RNA(lncRNA)的作用仍不明确。近年来，lncRNA在癌症中的调控作用备受关注，例如LINC00162(PICSAR)和THOR在cSCC中高表达，而GAS5和TINCR表达下调，但系统性研究仍缺乏。

为填补这一空白，斯坦福大学的研究团队通过整合单细胞转录组学和功能基因组学技术，首次绘制了cSCC角质形成细胞亚群特异的lncRNA图谱，并鉴定出关键促癌lncRNA及其分子机制。研究成果发表于《Journal of Investigative Dermatology》，为理解肿瘤异质性提供了新视角。

研究采用四大关键技术：(1)基于FANTOM CAT数据库重新注释人类cSCC单细胞RNA-seq(scRNA-seq)数据；(2)通过DESeq2进行伪批量分析鉴定亚群特异性lncRNA；(3)体外和体内CRISPR干扰(CRISPRi)筛选构建双文库(含9590个sgRNA)；(4)结合ASO(反义寡核苷酸)敲降和smRNA-FISH(单分子RNA荧光原位杂交)验证临床相关性。

cSCC角质形成细胞亚群表达特异性lncRNA
通过分析正常和肿瘤组织的scRNA-seq数据，研究人员发现294个lncRNA在cSCC四大亚群（基底、周期、分化角质形成细胞及肿瘤特异性角质形成细胞TSK）中差异表达。TSK亚群特异性表达116个lncRNA，显著高于其他亚群（基底56个、周期39个、分化30个），提示lncRNA可能作为细胞状态标记物。

功能性lncRNA的筛选与验证
利用FANTOM CAT数据库的功能注释（如DNA保守性、GWAS关联等），从241个候选lncRNA中筛选出176个具有潜在功能的lncRNA。TSK相关lncRNA中75%为基因间型，这类lncRNA更可能具有调控功能。

体外CRISPRi筛选鉴定影响cSCC增殖的lncRNA
设计靶向176个lncRNA转录起始位点（TSS±650bp）的sgRNA文库，在A431（皮肤）和Cal27（口腔）SCC细胞系中筛选。通过β-score分析发现，31个（A431）和22个（Cal27）lncRNA敲降显著抑制细胞增殖，其中7个（包括LINC00704和LINC01116）在两种细胞系中均有效。

体内实验证实lncRNA调控肿瘤生长
在小鼠异种移植模型中，LINC00704和LINC01116敲除显著减小肿瘤体积。TCGA分析显示，LINC00704高表达与SCC患者生存率降低显著相关（p<0.05），smRNA-FISH证实其在人类cSCC组织中特异性高表达。

分子机制解析
RNA-seq揭示LINC00704和LINC01116通过共同通路（如细胞周期、DNA修复）和拮抗通路（如氧化应激、表皮分化）调控肿瘤生长。例如，LINC00704促进而LINC01116抑制角质形成细胞分化相关基因，这种"阴阳"调控模式可能维持肿瘤干细胞特性。

这项研究首次系统阐明了lncRNA在cSCC亚群特异性调控中的作用，尤其揭示了TSK亚群依赖LINC00704/LINC01116维持恶性表型的分子机制。临床关联性分析表明LINC00704可作为预后标志物，而双lncRNA的拮抗作用为靶向肿瘤异质性提供了新策略。未来研究可进一步探索这些lncRNA如何整合到已知信号网络（如NOTCH或p53通路），以及其作为联合治疗靶点的潜力。