寡核苷酸纯化新突破：分析型IP-RP-HPLC方法向半制备规模的放大策略

本研究针对寡核苷酸（ONs）纯化过程中色谱方法放大缺乏实践指导的难题，开发了从分析型离子对反相高效液相色谱（IP-RP-HPLC）到半制备规模的放大策略。通过优化线性流速、载样量和梯度曲线等参数，研究人员采用相同树脂的DNAPac? RP系列色谱柱，实现了分析级与制备级分离谱图的高度匹配，最终获得纯度≥92.9%、回收率94.1-99.3%的ONs产物。该研究为核酸治疗药物的规模化纯化提供了可复制的技术框架。

　　

在基因治疗和分子诊断快速发展的今天，合成寡核苷酸（Oligonucleotides, ONs）作为CRISPR-Cas基因编辑工具的核心组件和治疗性核酸药物的基础材料，其纯度直接决定最终应用效果。然而，通过固相亚磷酰胺化学法合成的ONs总是伴随着各种杂质——缺失序列（N-x）、加长序列（N+x）以及修饰不完全的副产物，这些"分子近亲"的分离堪称色谱领域的"针尖对麦芒"。尤其当目标序列超过20个碱基时，传统纯化方法往往力不从心。

目前，离子对反相高效液相色谱（Ion-Pair Reversed-Phase HPLC, IP-RP-HPLC）因其能区分长度相同但修饰不同的ONs而备受青睐。但文献中关于如何将分析级方法放大到制备规模的操作细节却如同"散落的拼图"，使得研究人员常要耗费数月进行条件摸索。更棘手的是，常用的六氟异丙醇（HFIP）缓冲体系虽然质谱兼容性好，但其高昂成本和腐蚀性让制备级应用举步维艰。

针对这些技术瓶颈，来自Thermo Fisher Scientific Baltics的研究团队在《Journal of Chromatography B》发表了一项开创性研究。他们以三乙基乙酸铵（TEAA）为离子对试剂，采用DNAPac? RP系列色谱柱（4 μm超大孔聚合物树脂），通过系统考察流速、载样量与柱尺寸的动力学等效关系，成功将分析型IP-RP-HPLC方法放大到半制备规模。令人振奋的是，这种"放大镜式"的精准放大不仅保持了分离分辨率，单次纯化即可获得药用级纯度（最高达99.3%），更突破了HFIP依赖的桎梏，为工业化生产铺平了道路。

关键技术方法包括：1）采用同一HPLC系统通过硬件配置切换实现分析/制备模式；2）基于线性流速等效原则计算放大参数；3）优化梯度曲线补偿柱体积变化；4）使用醋酸缓冲体系替代HFIP降低成本。研究样本涵盖单链/双链合成ONs及修饰核酸。

【HPLC方法开发】
通过调节三乙胺浓度（50-400 mM）和pH（6.5-8.5），团队发现150 mM TEAA（pH 7.5）能平衡分离效率与系统稳定性。关键突破在于识别出烷基胺浓度＞200 mM时会形成胶束，使分离机制从离子对作用转变为胶束色谱，这解释了传统方法放大失败的原因。

【材料与试剂】
选择醋酸而非HFIP作为反离子，虽然质谱信号强度降低20%，但溶剂成本节省85%，且色谱柱寿命延长3倍。1-己胺的引入显著提升了对磷酸二酯键修饰ONs的选择性。

【结论】
该研究建立了"三等效"放大原则：① 线速度等效保证保留时间一致；② 载样量/柱体积比等效维持分离度；③ 梯度体积/柱体积比等效确保洗脱曲线重叠。对于25-mer ONs，在4.6×150 mm分析柱与21.2×250 mm制备柱间转换时，流速从1 mL/min增至21 mL/min仍能保持Δt<0.3 min。

【讨论】
这项工作的深远意义在于：首先，证实醋酸缓冲体系在制备级纯化中的可行性，单批次可处理500 μg ONs而纯度不衰减；其次，提出的放大模型适用于DNAPac? RP全系列色谱柱，包括新开发的半制备柱型；最重要的是，纯化后的ONs可直接用于体内实验，无需二次脱盐。作者特别指出，该方法对含硫代磷酸酯（phosphorothioate）的治疗性反义核酸纯化效果尤为突出，这对RNAi药物开发具有重要价值。未来研究将探索该平台在信使RNA（mRNA）纯化中的应用潜力。