代谢工程改造大肠杆菌实现异戊烯基柚皮素化合物的从头合成

研究人员针对异戊烯基柚皮素(PN)化合物天然含量低、提取困难的问题，通过代谢工程改造大肠杆菌(E. coli)构建了完整的生物合成途径。研究利用CRISPR-Cas12a技术构建了10种DMAPP强化的E. coli菌株，筛选出表达来自玫瑰色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)的可溶性芳香异戊烯基转移酶(CloQ)的最佳生产菌株E. coli M-PAR-121:EcDXS。在生物反应器规模优化后，获得了135.33 mg/L的3'-PN和8.72 mg/L的6-PN产量，这是首次报道利用E. coli实现PN化合物的从头合成，为这类具有抗癌、抗病毒等生物活性的高价值化合物提供了高效环保的生产方案。

　　

异戊烯基柚皮素(Prenylnaringenin, PN)化合物因其独特的生物活性备受关注，包括抗癌、抗病毒、抗炎和雌激素样作用。这类化合物在自然界中含量极低，传统植物提取方法效率低下且成本高昂。微生物细胞工厂为PN化合物的生产提供了新思路，但面临两大挑战：一是需要构建完整的生物合成途径，二是关键的异戊烯基转移酶(Prenyltransferase, PT)反应需要充足的二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)作为底物。

为解决这些问题，葡萄牙生物技术与生物医学研究所的研究人员与曼彻斯特大学合作，在《Journal of Biotechnology》发表了一项开创性研究。他们以先前优化的柚皮素生产菌株E. coli M-PAR-121为基础，通过整合多种技术手段，首次实现了PN化合物在大肠杆菌中的从头合成。

研究采用了多项关键技术：1) CRISPR-Cas12a系统用于基因组编辑，构建DMAPP强化的E. coli菌株；2) 异源表达11种不同来源的PT酶；3) 96孔深孔板高通量筛选系统；4) 摇瓶和生物反应器规模的生产优化。研究团队还建立了完善的代谢产物分析方法，包括超高效液相色谱(UHPLC)和高效液相色谱(HPLC)。

在菌株构建方面，研究人员首先评估了11种PT的表达情况。植物来源的PT(如来自啤酒花Humulus lupulus的HlPT)由于是膜结合蛋白，在E. coli中表达困难；而微生物来源的可溶性PT(如来自玫瑰色链霉菌的CloQ)则成功表达。随后，他们利用CRISPR-Cas12a系统在E. coli M-PAR-121的lacZ位点整合了DXS和IDI基因，构建了10种DMAPP强化的菌株。这些基因包括来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的BsDXS、来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ScIDI等异源基因，以及E. coli自身的EcDXS和EcIDI。

通过96孔深孔板筛选，研究人员从110种菌株/PT组合中鉴定出12种能够从头合成PN的生产菌株。其中，E. coli M-PAR-121:EcDXS表达CloQ的组合表现最佳。在摇瓶实验中，该菌株在TB培养基中产量最高，达到160.57 μM的3'-PN、4.4 μM的6-PN和2.66 μM的8-PN。

在生物反应器规模实验中，研究人员观察到更高的产量。初始批次实验获得了191.94 μM的3'-PN和9.9 μM的6-PN。通过添加两次葡萄糖脉冲(每次10 g/L)，最终产量提升至397.57 μM的3'-PN(135.33 mg/L)和25.61 μM的6-PN(8.72 mg/L)，这是目前报道的最高从头合成产量。

这项研究具有多重重要意义：首先，这是首次在大肠杆菌中实现PN化合物的从头合成，突破了传统植物提取和微生物转化方法的局限；其次，建立的CRISPR-Cas12a介导的DMAPP强化策略为其他异戊烯基化产物的生产提供了参考；最后，研究证实微生物来源的可溶性PT(如CloQ)比植物PT更适合在E. coli中表达，为相关酶工程研究指明了方向。这项成果为PN化合物的工业化生产奠定了基础，也为开发其他高价值异戊烯基化天然产物提供了新思路。