全基因组CRISPR筛选揭示内体成熟蛋白WDR91促进黑色素瘤中反义寡核苷酸（ASO）的活性机制

这篇研究通过全基因组CRISPR筛选技术，在黑色素瘤细胞系中系统鉴定了调控反义寡核苷酸（ASO）活性的关键因子。研究发现内体成熟蛋白WD重复结构域91（WDR91）能显著促进三环DNA（tcDNA）和锁核酸（LNA）两类ASO的活性，并通过多细胞系验证揭示了该调控作用的细胞类型特异性。研究为优化ASO递送效率提供了新靶点，对神经肌肉疾病和肿瘤的ASO治疗具有重要指导意义。

　　

全基因组CRISPR筛选揭示内体成熟调控新机制

研究团队通过创新性地运用全基因组CRISPR敲除筛选技术，在501Mel黑色素瘤细胞系中系统探索了调控反义寡核苷酸（ASO）活性的关键细胞因子。这项发表在分子治疗-核酸领域的重要研究，为优化ASO药物的递送效率提供了全新的分子视角。

ASO治疗面临的挑战与机遇

反义寡核苷酸（ASO）作为治疗神经肌肉疾病和代谢紊乱的新型药物，已有多款获得FDA批准。然而其细胞内吞和运输机制仍不清楚，特别是仅有少量ASO能到达正确细胞区室。研究团队选择黑色素瘤作为模型，因其快速增殖特性有利于ASO摄取研究。通过设计特异性靶向TYRP1 mRNA的靶位点阻断剂（TSB）ASO，建立了一套可靠的活性评价体系。

创新筛选策略的设计与实施

研究采用第三代ASO化学修饰——三环DNA（tcDNA）构建筛选系统，相比传统锁核酸（LNA）ASO，tcDNA在低剂量下展现出更强的抗增殖活性。利用Brunello全基因组CRISPR敲除文库（包含76,441个sgRNA）感染501Mel细胞，通过72小时ASO处理后，采用新一代测序分析存活细胞中的sgRNA分布。这种功能性筛选策略克服了传统pull-down方法破坏膜完整性的局限，在生理状态下全面鉴定ASO调控网络。

关键调控因子的发现与验证

数据分析鉴定出95个潜在激活因子和55个抑制因子。其中内体成熟相关蛋白WDR91的敲除使tcDNA-ASO活性降低最显著（p=0.0011）。验证实验显示：

1. WDR91敲除不影响ASO总摄取量，但显著降低其功能活性
2. 该效应在LNA-ASO中同样存在（p=0.0154）
3. 在U2OS骨肉瘤和PC9肺腺癌细胞中，WDR91敲除使MALAT1缺口酶（GM）活性降低26-29%
4. 肌肉细胞中WDR91对剪接转换ASO（SSO）活性无影响，表明其调控具有细胞类型特异性

分子机制与治疗意义

WDR91作为Rab7效应分子，通过负调控磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）参与早期到晚内体的转化过程。研究表明：
• 内体成熟过程是ASO释放的关键环节
• 不同细胞系存在替代调控通路（如肌肉细胞中ANXA2起主导作用）
• 内体循环和MVB融合是潜在调控靶点

该研究不仅完善了ASO胞内运输的理论框架，更为针对性地提高ASO疗效提供了新策略——通过调控WDR91等内体成熟相关蛋白，有望显著增强ASO在肿瘤等疾病治疗中的效果。