CRISPR-Casλ2的结构基础揭示靶DNA切割和向导RNA加工的分子机制

本研究通过冷冻电镜技术解析了噬菌体编码的微型CRISPR-Casλ2核酸酶在五种功能状态下的结构动态，揭示了其通过RuvC活性中心以"分子标尺"机制加工前体crRNA的独特方式，并阐明了靶DNA切割的域重排机制。该研究为开发基于CRISPR-Casλ的基因组编辑平台提供了结构基础，对理解多样化V型CRISPR-Cas效应蛋白的分子机制具有重要意义。

　　

在基因组编辑技术飞速发展的今天，科学家们一直在寻找更小巧、更高效的CRISPR-Cas系统。传统使用的Cas9和Cas12a虽然功能强大，但其较大的体积限制了在基因治疗等应用中的使用。与此同时，科学家们在噬菌体基因组中发现了一类被称为Casλ（也称Cas12n）的微型CRISPR-Cas效应蛋白，它们体积仅为传统Cas蛋白的一半左右，却展现出在真核细胞中的编辑活性。然而，这类新型核酸酶的分子工作机制仍是一个未解之谜。

日本东京大学等机构的研究人员Satoshi N.Omura等人在《Communications Biology》发表的研究，通过宏基因组和系统发育分析鉴定出CRISPR-Casλ2作为Casλ家族的新成员。研究人员采用冷冻电镜技术解析了Casλ2与crRNA和靶DNA复合物在五种不同功能状态下的结构，揭示了其独特的"分子标尺"机制和前体crRNA加工方式，阐明了靶DNA切割过程中的动态域重排机制。这项研究不仅增进了对多样化CRISPR-Cas核酸酶工作机制的理解，也为开发基于CRISPR-Casλ的基因组编辑平台奠定了结构基础。

研究采用了多项关键技术方法：通过大肠杆菌负选择筛选系统鉴定Casλ2的DNA干扰活性；利用体外DNA切割实验分析酶活性和PAM特异性；采用冷冻电镜技术解析Casλ2在五种功能状态下的三维结构；通过体外pre-crRNA加工实验阐明其成熟机制；利用系统发育分析确定Casλ2的分类地位。

研究结果

Casλ2系统的鉴定与表征

通过宏基因组追踪和系统发育分析，研究人员从牛肠道微生物组样本中鉴定出一个741个氨基酸的ORF，命名为CRISPR-Casλ2。大肠杆菌负选择筛选实验显示，Casλ2能有效靶向双链DNA，且仅需crRNA而不依赖tracrRNA。体外DNA切割实验证实Casλ2偏好5'-TTR-3'（R为A或G）的PAM序列，其中对TTA的活性略高于TTG。

Casλ2介导的dsDNA切割生化特性

Casλ2在25-100 mM NaCl浓度和37-55°C温度范围内表现出最佳切割活性。16-18 nt的向导RNA长度最为适宜，这与后续结构观察到的17 bp向导-靶标异源双链长度一致。切割位点分析显示，Casλ2在PAM下游23 nt处切割靶链（TS），在19或20 nt处切割非靶链（NTS），产生3-4 nt的5'突出端。

Casλ2-crRNA-靶DNA三元复合物的冷冻电镜结构

2.9 ?分辨率的冷冻电镜结构显示，Casλ2采用双叶结构，由识别叶（REC，含WED、REC1和REC2结构域）和核酸酶叶（NUC，含RuvC、REC3和TNB结构域）组成。RuvC结构域具有典型的RNase H折叠，含有由Asp324、Glu526和Asp680组成的催化中心。crRNA支架由茎和茎环组成，缺乏大多数Cas12酶中保守的假结结构。

crRNA和靶DNA的识别机制

crRNA茎部被WED和RuvC结构域识别，茎环暴露于溶剂中。靶DNA形成17 bp的向导-靶标异源双链和10 bp的PAM双链。PAM双链被WED和REC1结构域特异性识别，其中Asn89、Thr113等残基对PAM识别至关重要。在RuvC活性位点观察到6 nt的单链DNA密度，代表催化活性状态。

Casλ2激活过程中的伴随构象变化

研究人员解析了Casλ2在四种功能状态下的结构：催化失活状态（State I）中RuvC和TNB结构域无序；中间状态（State II）中RuvC活性位点形成但未结合底物DNA；NTS切割状态（State III）中非靶链进入RuvC活性位点；TS切割状态中靶链沿REC3结构域表面进入RuvC活性位点。这些结构揭示了REC2、RuvC和TNB结构域在激活过程中的协同构象重排。

Casλ2介导的向导RNA加工

体外实验显示，Casλ2通过RuvC活性中心加工rsr型前体crRNA，但不切割srs型前体。不同于Cas12c和Cas12j，Casλ2采用独特的"分子标尺"机制：通过识别上游重复序列，在下游16-18 nt处切割，定义成熟crRNA的间隔长度。3.0 ?分辨率的Casλ2-pre-crRNA二元复合物结构显示，12 nt的间隔区被锚定在带正电的中心沟中，其余部分则向RuvC活性位点弯曲。

讨论与结论

该研究通过多状态结构解析，阐明了Casλ家族酶的激活机制。与Casλ1相比，Casλ2通过REC3结构域更严格地识别17 bp的向导-靶标异源双链。尽管序列相似性低（37%），Casλ1和Casλ2在结构上高度同源（RMSD 0.912 ?），显示出Casλ家族酶的保守特征。与细菌或古菌编码的Cas12酶不同，噬菌体编码的V型CRISPR-Cas效应蛋白（如CasΦ和Casλ）可能独立进化自TnpB。

这项研究的重要意义在于：首次揭示了Casλ2通过"分子标尺"机制加工前体crRNA的独特方式；阐明了其靶DNA切割的构象变化路径；为理解噬菌体编码的微型CRISPR-Cas系统进化提供了新见解。由于Casλ2等噬菌体编码效应蛋白的紧凑尺寸（约750个氨基酸），它们特别适合用于需要AAV载体递送的体内基因治疗应用。该研究建立的分子框架将促进基于CRISPR-Casλ的基因组编辑工具的理性设计，为开发新一代微型基因编辑系统奠定基础。