肉毒杆菌神经毒素A突变体通过增强神经节苷脂结合能力提升效价并改变选择性

为解决肉毒杆菌神经毒素A(BoNT/A)因天然受体结合特性限制其临床疗效的问题，研究人员通过定向筛选策略鉴定出关键突变体Y1117V和H1253K，显著增强其与神经节苷脂(GT1b/GD1a)的结合能力，并通过X射线晶体学和受体结合实验阐明分子机制。该研究为开发高效、靶向性更强的BoNT/A治疗变体奠定基础，对神经肌肉疾病治疗具有重要意义。

　　

肉毒杆菌神经毒素（Botulinum neurotoxin, BoNT）是已知毒性最强的蛋白质之一，既是导致致命性肉毒中毒的病原体，又是治疗多种神经肌肉疾病的重要药物。然而，天然BoNT/A对神经细胞表面受体（神经节苷脂和SV2糖蛋白）的结合特性限制了其临床疗效和应用范围。特别是，神经节苷脂作为初始识别靶点，其结合效率直接影响毒素的效价和细胞选择性。目前，如何通过改造BoNT/A的受体结合特性以提升治疗效果，成为神经毒素领域的关键科学问题。

针对这一挑战，瑞典斯德哥尔摩大学等机构的研究人员Geoffrey Masuyer、Andreas Rummel和P?l Stenmark在《Communications Chemistry》发表了一项突破性研究。他们通过系统改造BoNT/A的神经节苷脂结合位点（Ganglioside Binding Site, GBS），成功开发出结合能力增强且选择性改变的突变体，为下一代BoNT/A药物的设计提供了分子基础。

研究团队采用多学科技术手段，包括：1）基于大鼠脑突触体结合实验的高通量突变体筛选；2）小鼠膈神经半膈肌离体实验（MPN）评估突变体效价；3）等温滴定量热法（ITC）定量分析突变体与神经节苷脂（GD1a/GM1a）的结合热力学；4）X射线晶体学解析突变体-神经节苷脂复合物结构（分辨率1.6-1.9 ?）；5）酶联免疫吸附试验（ELISA）测定突变体对不同神经节苷脂（GT1b/GD1b/GD1a/GM1a）的选择性。

突触体结合筛选揭示关键突变位点
通过系统突变GBS核心残基，发现Y1117V突变使突触体结合能力提升3.5倍，而H1253K突变则改变神经节苷脂偏好性。结构分析表明，Y1117V突变通过移除酪氨酸庞大的芳香环，为神经氨酸（Neu5Ac5）创造了更优的疏水结合口袋；H1253K则通过赖氨酸侧链与半乳糖胺（GalNAc3）形成新氢键网络。

效价提升的生物学验证
MPN实验显示，Y1117V和H1253K单突变体效价比野生型提高1.7-4.1倍，而双突变体Y1117V/H1253K效价提升达5.5倍，证实增强神经节苷脂结合可显著加速毒素作用。

结合机制的结构生物学解析
晶体结构显示，Y1117V突变诱导1270-1279环区构象变化，新增R1276与Neu5Ac5的氢键；H1253K则偏好结合缺乏末端Neu5Ac的GM1a/GD1b。ITC测定Y1117V对GD1a的解离常数（K_D
）从野生型的1 mM降至0.11 mM。

神经节苷脂选择性的重编程
ELISA证实H1253K突变体对GM1a/GD1b的结合能力显著增强（EC₅₀
降低50%），而Y1117V/H1253K双突变体保持对GD1a/GT1b的高选择性（EC₅₀
=0.09-0.14 μM）。

这项研究首次系统阐明了BoNT/A神经节苷脂结合域的优化策略及其结构基础。Y1117V通过扩大疏水口袋增强结合，而H1253K通过电荷互作改变选择性，二者协同可实现效价与选择性的双重调控。这些发现不仅为开发治疗窗更广的BoNT/A变体提供直接依据，更开创了通过精准改造碳水化合物识别机制来优化神经毒素药物的新范式。由于不同神经元亚群表达特异的神经节苷脂谱（如感觉神经元高表达GM1a），这些突变体有望实现针对特定神经回路的选择性靶向，为疼痛、自主神经功能障碍等新适应症拓展奠定基础。