基于CRISPR-Cas9的高通量代谢工程技术实现耶氏酵母基因表达精准调控

这篇研究开创性地开发了CRISPR-Cas9驱动的TUNEYALI方法，通过启动子替换策略在工业酵母Yarrowia lipolytica中实现高通量基因表达调控。研究者构建了靶向56个转录因子（TFs）的质粒文库，通过七级启动子强度梯度调控，成功筛选出提升甜菜红素产量、耐热性和形态优化的工程菌株，为合成生物学和工业生物技术提供了可扩展的标准化工具。

　　

开发无痕启动子替换方法

针对传统CRISPR-Cas9技术在Yarrowia lipolytica中多靶点编辑效率低的问题，研究团队创新性地将sgRNA与同源修复模板整合至单一质粒。通过测试62bp、162bp和500bp三种同源臂长度，发现162bp同源臂在编辑效率（56.3-68.1%）与合成成本间取得最佳平衡。关键设计在于SapI酶切位点的引入，其产生的ATG起始密码子避免了启动子与编码区之间的序列疤痕。

构建高通量基因组编辑工具包TUNE^YALI

从270个候选转录因子中筛选出60个高表达或关键调控因子，设计包含sgRNA-scaffold和162bp同源臂的500bp合成片段。通过Golden Gate组装将6个梯度强度启动子（PrDGA、PrTPI等）插入56个靶基因位点，纳米孔测序验证文库覆盖度达99.9914%。启动子强度通过mNeonGreen荧光蛋白报告系统量化，其中PrTEF驱动表达量最高，达野生型的15倍。

应用于耶氏酵母形态工程

在转化TUNE^YALI-TF文库的1,000余个克隆中，发现3个完全抑制假菌丝形成的突变体。测序显示TF23（GCN4同源物）启动子被PrTEF替换、TF48启动子被PrFBA替换，二者均首次被证实参与形态调控。值得注意的是，这些突变体同时表现出黑色素异常积累，暗示应激响应通路与形态转换存在交叉调控。

提升菌株耐热性能

在35℃高温筛选中获得8个生长优势菌株，涉及SNF2同源物（TF07）等7个独特靶点。其中TF25（启动子删除）和TF23（PrGPD替换）突变株的比生长速率提升达55%。特别发现YALI1_D30097g（SNF2同源物）与酿酒酵母SWI/SNF复合体类似，在热应激响应中发挥保守功能。

优化甜菜红素生物合成

在已理性改造的产甜菜红素菌株ST12603中，通过红色表型筛选获得128个阳性克隆。top4突变体使单位OD₅₃₅值提升24.5%，关键靶点包括：SWI/SNF复合体亚基SNF5（TF14，PrDGA替换后产量达188mg/L）、缺氧响应因子IXR1（TF56，PrTEF替换后130mg/L）。反向工程验证显示，双/三突变组合未产生协同效应，表明转录调控存在阈值效应。

技术优势与局限

相比细菌的核糖体结合位点（RBS）调控，酵母长启动子（中位数455bp）的替换策略更具挑战性。该方法支持迭代编辑但每轮仅引入单一位点突变，且需结合EXPRESS^YALI等技术实现外源基因整合。研究者将质粒文库（AddGene #217744）标准化，为功能基因组学和工业菌株开发提供共享资源。

这项研究通过模块化设计解决了非模式酵母多基因调控的技术瓶颈，首次在Yarrowia lipolytica中实现转录因子网络的系统性扰动，为微生物细胞工厂的智能化设计提供了范式。