微流控电镜联用技术实现高通量抗体-病毒糖蛋白复合物快速图谱解析

研究人员开发了微流控电镜联用技术(mEM)，通过整合微流控芯片与单颗粒电镜技术，仅需4μl血清即可在90分钟内完成多克隆抗体表位图谱分析。该技术突破了传统EMPEM方法耗时长(>1周)、样本需求量大(>500μl)的限制，在SARS-CoV-2、流感HA和HIV Env等病毒糖蛋白研究中，检测表位数量较传统方法提升30%，为疫苗设计提供了高效的结构生物学工具。

　　

在疫苗研发领域，解析抗体与病毒表面糖蛋白的相互作用机制至关重要。传统方法如酶联免疫吸附试验(ELISA)仅能检测结合活性而无法定位表位，单克隆抗体分离又存在耗时长、低估应答多样性的缺陷。虽然电镜多克隆表位作图(EMPEM)技术能提供结构信息，但其繁琐的样本纯化流程(需>0.5ml血清和>1周时间)严重制约了在临床研究中的应用。

美国斯克里普斯研究所Andrew B. Ward团队在《Nature Biomedical Engineering》发表的研究，开发出微流控电镜联用技术(microfluidic EM-based polyclonal epitope mapping, mEM)。该技术通过微流控芯片中的自组装单分子层(SAM)固定Strep-TactinXT捕获蛋白，仅需4μl血清和90分钟即可完成免疫复合物制备，较传统方法效率提升50倍。研究团队运用负染电镜(ns-EM)和冷冻电镜(cryo-EM)解析了SARS-CoV-2刺突蛋白(S)、流感血凝素(HA)和HIV Env三聚体的抗体结合位点，发现mEM能检测到更多SD2、S2等新型表位。

关键技术包括：1) 微流控芯片集成金表面SAM支架构建；2) Twin-Strep标签糖蛋白的可逆固定技术；3) 直接血清样本的抗体-抗原复合物快速洗脱；4) 单颗粒冷冻电镜解析技术。人类样本来自COVID-19康复者及流感疫苗接种者，小鼠样本取自HIV N332-GT5 mRNA疫苗免疫模型。

Development of mEM technology
通过表面等离子共振(SPR)优化2.5 mM 16-巯基十六烷酸(MHDA)修饰浓度，实现每微米²75-270个病毒糖蛋白颗粒的捕获效率。可重复使用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片配合石墨烯载网，使设备循环使用次数>4次。

Capture and characterization of viral glycoproteins
成功固定季节性冠状病毒(OC43/HKU1)S蛋白、H1N1流感HA和HIV Env N332-GT5三聚体。冷冻电镜解析OC43 S闭合构象(3.3 ?)和流感B型HA(3.0 ?)结构，SARS-CoV-2 S蛋白则获得4.6 ?(闭合态)和6.9 ?(开放态)两种构象图谱。

Structural analysis of antibody-glycoprotein binding
使用靶向NTD超位点的TXG-0078(Fab形式)和结合RBD的CC6.30.2(IgG形式)单抗验证技术可靠性。在COVID-19康复者血清中，mEM检测到传统方法遗漏的SD2靶向抗体，证实IgG双功能性能提升低丰度抗体捕获率。

Rapid analysis of memory-and vaccine-elicited responses
对流感疫苗接种者血清分析显示，mEM可同时检测季节性CoV S蛋白的预存抗体(CTD、S2表位)和疫苗诱导的HA新表位(包括首次发现的protomer-protomer界面抗体)，仅消耗0.8%样本量(16μl vs 2ml)。

Longitudinal polyclonal antibody mapping in individual mice
在HIV疫苗小鼠模型中，突破传统方法需要6-8只动物血清混合的限制，实现单个小鼠V1/3环表位抗体的纵向追踪(第12-42天)，为临床前研究提供个体化应答数据。

该研究建立的mEM技术体系具有三大突破性意义：首先，将样本处理时间从>1周缩短至1.5天，使大规模临床样本分析成为可能；其次，双功能IgG的应用显著提高低亲和力抗体检出率；最后，微升级样本需求使得珍贵生物样本库和小儿临床试验样本得以利用。研究者特别指出，该技术检测到的protomer-protomer界面抗体与最新报道的记忆B细胞低频抗体特征吻合，证实其高灵敏度。未来通过整合自动化多抗原系统，mEM有望成为感染机制研究和疫苗设计的标准化平台。