香蕉原生质体高效转染体系的建立及其在无转基因基因组编辑中的应用

为解决香蕉等无性繁殖作物无转基因基因组编辑的难题，研究人员优化了香蕉品种Grand Naine的胚胎细胞悬浮系(ECS)原生质体分离与转染体系。通过PEG介导的pCAMBIA1302/pJL50TRBO载体转染实现30%-70%的GFP表达效率，并采用1:2摩尔比的SpCas9/gRNA1核糖核蛋白复合体(RNP)靶向β-胡萝卜素羟化酶基因，获得7%的indel频率。该研究为香蕉基因功能验证和无转基因品种培育提供了高效技术平台。

　　

CRISPR/Cas9系统的革新使植物基因组编辑变得简单高效，但对香蕉这类无性繁殖作物而言，培育无转基因(transgene-free)品种仍具挑战。最新研究以香蕉品种Grand Naine为材料，建立了一套基于原生质体的高效编辑平台。

研究者对比了叶片和胚胎细胞悬浮系(ECS)的原生质体制备效果，发现新鲜ECS是最佳来源。通过聚乙二醇(PEG)介导的转染实验，pCAMBIA1302和pJL50TRBO载体分别实现30%和70%的绿色荧光蛋白(GFP)表达效率，验证了体系可靠性。

针对香蕉β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase)基因设计的gRNA，经体外(in-vitro)切割实验验证后，与SpCas9蛋白按不同比例(1:1至1:10)形成核糖核蛋白复合体(RNP)。其中1:2比例效果最佳，产生7%的插入缺失(indel)频率。测序显示突变主要发生在PAM序列上游区域。

值得注意的是，gRNA在体外和体内(in-vivo)实验中的表现存在差异，凸显了全面体内验证的必要性。该优化体系为香蕉基因功能研究和无转基因品种培育提供了重要技术支撑，特别适用于这种传统育种困难的作物。