海鞘细胞标记与基因编辑工具的突破性开发及其在发育生物学中的应用

为解决海鞘(Ciona)模型中细胞分辨率基因操作工具匮乏的难题，中国海洋大学团队成功构建了多功能Gateway载体系统，优化了CRISPR/Cas9/dCas9技术平台，开发出可实时监测基因编辑的双荧光传感器。该研究实现了蛋白质亚细胞定位可视化、组织特异性基因敲除/敲降，为海洋模式生物发育机制研究提供了全新工具集。

　　

在海洋发育生物学领域，尾索动物海鞘(Ciona)因其透明的胚胎和保守的脊索动物发育特征，成为研究胚胎发生和进化的重要模型。然而长期以来，该领域面临两大技术瓶颈：一是缺乏高效的多功能细胞标记工具，难以实现蛋白质动态追踪和亚细胞定位；二是现有CRISPR/Cas9基因编辑系统存在表达不可见、编辑效率评估困难等问题，阻碍了单细胞水平的功能研究。

为突破这些限制，中国海洋大学方宗熙海洋生物进化与发育研究中心的科研团队开展了一项创新性研究。他们成功开发了Gateway兼容的载体系统，优化了CRISPR基因编辑技术，并构建了可实时监测编辑效率的双荧光报告系统。这项发表于《Marine Life Science》的研究，为海洋模式生物的细胞生物学研究提供了全新工具箱。

研究主要采用四大关键技术：1)基于Minos转座子的双Gateway载体构建，实现N/C端多色荧光标记；2)融合P2A-mCherry的CRISPR/Cas9系统优化，实现编辑活性可视化；3)组织特异性启动子驱动的dCas9-KRAB基因敲降系统；4)基于Brachyury启动子的Cas9-sensor双荧光报告系统，用于实时监测编辑事件。实验样本来自中国荣成海域采集的成年海鞘。

Gateway载体系统的建立
研究团队构建了包含Minos转座元件的双Gateway载体pMGD，支持N端(pMGD-N-FP)或C端(pMGD-C-FP)融合TagBFP/CFP/YFP/mCherry等7种荧光蛋白。通过Notochord特异性启动子驱动，成功标记了微管结合蛋白Ensconsin-3xGFP、核孔蛋白Nup50-mCherry等，首次实现相邻脊索细胞的多色区分标记。

CRISPR/Cas9系统的优化
比较三种Cas9变体发现，NLS::Cas9::NLS::P2A::mCherry在保持42%编辑效率同时实现表达可视化。靶向Chondromodulin-1(Cr-ChM-1)基因的sgRNA2经T7E1检测证实可诱导13.9%的indel突变，免疫荧光显示Cas9-mCherry⁺细胞中Cr-ChM-1蛋白显著减少。

基因编辑可视化传感器
创新的Cas9-sensor系统包含靶序列-PAM-mCherry-EGFP串联结构。当靶序列被切割时，mCherry/EGFP荧光比值下降，该变化与Cr-ChM-1蛋白减少显著相关，首次实现单细胞水平编辑效率评估。

dCas9-KRAB基因敲降
在HEK293T细胞验证后，脊索特异性Cs-Bra>dCas9-KRAB::P2A::mCherry系统成功抑制Brachyury表达，导致胚胎体长缩短21.3%，并出现脊索细胞排列紊乱等典型表型。

这项研究构建了迄今最全面的海鞘基因操作平台，其创新性体现在：1)双Gateway系统支持多蛋白并行标记；2)P2A-mCherry报告实现了CRISPR编辑可视化；3)dCas9-KRAB拓展了基因功能研究维度；4)Cas9-sensor开创了编辑效率实时监测新方法。这些工具不仅适用于海鞘，其设计理念还可推广至其他模式生物，为发育生物学、进化生物学研究提供了关键技术支撑。特别值得注意的是，该研究全部工具载体已通过Addgene等平台共享，体现了中国团队对全球科学共同体的贡献。