Peposertib通过抑制对侧双切口介导的非同源末端连接修复阻断FLT3-ITD生成的机制研究

【编辑推荐】本研究针对急性髓系白血病(AML)中最常见的FLT3内部串联重复(ITD)突变起源机制不明的问题，通过深度测序发现FLT3外显子14回文序列处的基因组不稳定性，利用CRISPR/Cas9技术揭示对侧双切口通过非同源末端连接(NHEJ)途径高效生成ITD的特征，并证实DNA-PKcs抑制剂peposertib可显著抑制ITD形成，为预防治疗相关性FLT3-ITD提供了新策略。

　　

急性髓系白血病(AML)中FLT3内部串联重复(FLT3-ITD)突变如同一个挥之不去的幽灵，既是最高发的驱动突变(占AML病例25-30%)，又是导致高复发率和治疗抵抗的元凶。更令人困惑的是，这种突变在疾病进程中表现出"时隐时现"的特性——初诊阴性的患者可能复发时阳性，而初诊阳性的患者治疗后反而转阴。这种动态变化暗示FLT3-ITD可能是在疾病发展过程中不断新发产生的，但长期以来科学界对其形成机制知之甚少。

北海道大学的研究团队在《Experimental Hematology》发表的研究解开了这个谜团。他们发现FLT3外显子14存在一个30bp的回文样序列(palindrome-like sequence)，如同DNA分子中的"脆弱点"。通过分析20例AML患者的深度测序数据，不仅检测到预期的ITD克隆，还意外捕获到罕见的缺失克隆。研究人员大胆假设：这个特殊序列可能引发DNA双链断裂(DSB)，而错误的修复过程导致了ITD形成。

为验证这一假说，团队运用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人类和小鼠细胞系中精准制造DNA损伤。最关键的发现是：当在DNA两条互补链的相邻位置制造"对侧双切口"(contralateral double nicks)时，ITD的产生效率最高。这些人工诱导的ITD与临床样本中的突变特征高度相似，包括长度分布和连接处特性。更引人注目的是，比较两种DNA修复抑制剂的效果时，DSB修复抑制剂peposertib(DNA-PKcs抑制剂)能显著减少ITD形成，而单链断裂(SSB)修复抑制剂olaparib则无此效果，明确指向非同源末端连接(NHEJ)途径的关键作用。

关键技术方法包括：从Hokkaido Leukemia Net(HLN)多中心队列获取20例FLT3-ITD阳性AML样本进行深度测序；设计CRISPR/Cas9系统在FLT3 exon14回文序列区域诱导单切口、双切口及对侧双切口；使用olaparib和peposertib分别抑制SSB和DSB修复途径；通过生物信息学分析比较临床与人工ITD的特征。

研究结果揭示：

1. 深度测序发现DNA损伤修复特征：临床样本中95个ITD克隆、1个插入克隆和8个缺失克隆均聚集于FLT3 exon14回文序列区域，该区域30bp序列呈现不完全反向重复特征。
2. 对侧双切口高效诱导ITD：CRISPR/Cas9实验显示，相较于单切口或同侧双切口，对侧双切口产生ITD的效率提高3-5倍，且突变特征与临床ITD高度吻合。
3. 修复途径特异性抑制：Peposertib使ITD形成率降低60-80%，而olaparib无显著影响，证实NHEJ是ITD生成的主要修复机制。

讨论部分指出，这项研究首次阐明FLT3-ITD可能源于回文序列介导的基因组不稳定性，特别是对侧双切口通过NHEJ途径错误修复的过程。这不仅解释了FLT3-ITD在疾病进程中动态变化的分子基础，更重要的是揭示了peposertib作为DNA-PKcs抑制剂的新功能——预防治疗相关FLT3-ITD的产生。在临床实践中，化疗和放疗本身可能诱导DNA损伤，这项发现为开发降低治疗相关突变风险的联合策略提供了理论依据，对改善AML患者预后具有重要转化价值。