人天冬氨酸氨基转移酶多功能性与底物特异性的系统解析及其在D-天冬氨酸代谢中的潜在作用

【编辑推荐】日本科研团队针对哺乳动物D-天冬氨酸（D-Asp）生物合成途径不明的科学问题，系统研究了人天冬氨酸氨基转移酶（hGOT1/hGOT2）的多功能性。通过酶学实验证实hGOTs不具备D-氨基酸代谢活性，但首次发现其与草酰乙酸结合的独特动力学特征，为PLP依赖酶的功能演化提供了新见解。

　　

在哺乳动物神经和内分泌系统中，D-丝氨酸（D-Ser）和D-天冬氨酸（D-Asp）作为关键的D-氨基酸，分别通过结合NMDA受体调控突触可塑性和激素分泌。虽然D-Ser的生物合成已明确由丝氨酸消旋酶催化，但D-Asp的生成途径仍是未解之谜。近年有研究提出小鼠丝氨酸消旋酶可能具有天冬氨酸消旋活性，但组织分布差异表明存在其他合成途径。这一科学空白激发了日本北里大学Tetsuya Miyamoto团队对人天冬氨酸氨基转移酶（hGOT1/hGOT2）的多功能性展开系统研究，相关成果发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics》。

研究团队采用重组蛋白表达纯化、热位移分析（thermal shift assay）、酶动力学测定等关键技术，对hGOT1（胞质型）和hGOT2（线粒体型）进行了全面功能表征。通过构建多种酶活性检测体系，包括消旋酶、裂解酶、脱水酶和脱羧酶活性分析，并结合底物谱筛选和动力学建模，揭示了这两种同工酶的独特性质。

Purification and absorption spectra of recombinant hGOTs
研究首先在大肠杆菌中高效表达了重组hGOT1/hGOT2，经镍柱纯化获得均质蛋白。光谱分析证实其正确折叠为I型吡哆醛-5′-磷酸（PLP）依赖的四聚体结构，关键残基Lys259（hGOT1）和Lys279（hGOT2）形成希夫碱连接。

Substrate specificity profiling
酶活测试显示：1）hGOTs对L-天冬氨酸（L-Asp）和L-谷氨酸（L-Glu）表现出经典氨基转移活性，但对D型氨基酸完全无活性；2）意外发现草酰乙酸（oxaloacetate）的氨基转移反应呈现S型动力学曲线，突破传统米氏模型；3）热位移实验揭示PLP和草酰乙酸对蛋白稳定性的差异调控，提示hGOT1/2底物结合机制存在异构体特异性。

Multifunctional activity screening
系统评估五种酶活性发现：1）仅检测到微弱的L-丙氨酸消旋活性（<0.001%）；2）完全缺失天冬氨酸脱羧酶、β-裂解酶和脱水酶活性；3）排除了hGOTs参与D-Asp合成的可能性。

Conclusion
该研究首次全面解析了hGOTs的酶学特性，明确其不具备D-氨基酸代谢功能。发现的S型动力学特征为理解PLP酶变构调节提供了新视角，而异构体间底物结合能力的差异可能反映胞质与线粒体代谢微环境的适应性演化。尽管未发现D-Asp合成途径，但建立的系统研究方法为探索其他潜在多功能酶奠定了基础。

这项工作的科学价值在于：1）纠正了早期关于禽类天冬氨酸氨基转移酶具消旋活性的推论在人类同源酶中的适用性；2）揭示了临床常用肝功能标志物AST（即hGOTs）的精确分子机制；3）为开发特异性抑制剂提供了动力学依据。未来研究可基于该团队建立的技术平台，继续探索哺乳动物D-Asp合成的神秘途径。