丝状真菌Clonostachys sp. ZBS49高效合成桦木酸及其抑制肝癌细胞活性的创新研究

本研究针对植物提取法生产三萜类化合物（如桦木酸BA和齐墩果酸OA）效率低、污染大的问题，从171株内生真菌中筛选出高产菌株Clonostachys sp. ZBS49（BA产量47.7 mg/L）和Colletotrichum gloeosporioides XJ1-1（OA产量65.76 mg/L），通过培养基优化使BA产量提升506%至288.97 mg/L。首次证实ZBS49来源的BA可通过剂量依赖性抑制肝癌细胞（IC50 70μM），基因组分析揭示16个三萜合成相关基因及5个CYP450氧化酶基因。该研究为微生物合成高价值三萜化合物提供了新平台，发表于《Microbial Cell Factories》。

　　

三萜类化合物如桦木酸（Betulinic acid, BA）和齐墩果酸（Oleanolic acid, OA）因其抗癌、抗氧化等活性成为研究热点，但传统植物提取法存在效率低（BA最高仅3.33 mg/g）、过程复杂等问题。微生物合成虽具潜力，但已报道的丝状真菌产量普遍不足（如Phomopsis sp.产BA效率低下）。如何突破产量瓶颈并解析合成机制，成为领域关键挑战。

东北林业大学的研究团队通过大规模筛选171株植物内生真菌，首次发现Clonostachys sp. ZBS49能天然高产BA（47.7 mg/L），经ITS鉴定为与Clonostachys相似度99.82%的新菌株。通过单因素优化使BA产量提升至288.97 mg/L，创丝状真菌纪录。更引人注目的是，ZBS49来源的BA对肝癌细胞SMMC-7721和HepG2显示出剂量依赖性抑制（IC₅₀ 70μM），流式细胞术证实其可诱导细胞凋亡（凋亡率提升至30.1%）。基因组分析首次揭示该菌含16个三萜合成相关基因、2个三萜生物合成基因簇及5个可能参与C-28氧化的CYP450基因（如g04998等），为真菌三萜合成机制研究奠定基础。该成果发表于《Microbial Cell Factories》，为癌症治疗药物开发提供了新型微生物工厂。

关键技术方法包括：（1）从大豆、皂荚等植物分离171株内生真菌；（2）HPLC检测BA/OA产量（流动相乙腈:水=9:1，210 nm波长）；（3）LC-MS（Orbitrap Exploris 120质谱仪）验证代谢物；（4）单因素优化培养基（碳氮源、pH）；（5）Calcein AM/PI染色和划痕实验评估抗癌活性；（6）PacBio+Illumina双平台测序及AntiSMASH 7.0.0预测基因簇。

【筛选高产菌株】
通过HPLC分析从171株菌中筛选出BA高产菌ZBS49（47.7 mg/L）和OA高产菌XJ1-1（65.76 mg/L），LC-MS证实ZBS49能合成BA及甲基达嗪等衍生物。

【发酵优化】
发现豆粕培养基使ZBS49产量提升192%，优化后（10 g/L蔗糖、pH 6）BA产量达288.97 mg/L，DPPH清除率峰值85.55%。XJ1-1在20 g/L蔗糖、pH 5时OA产量86.14 mg/L。

【抗癌机制】
70μM BA处理24小时可使HepG2细胞凋亡率从4.9%升至30.1%，克隆形成实验显示其显著抑制癌细胞增殖（p<0.0001）。

【基因组解析】
ZBS49基因组57.91 Mb，含18,358个基因。鉴定出2个三萜合成基因簇（含CYP450、双加氧酶等）及5个与植物CYP716A同源的CYP450基因（如g08573），提示其可能催化lupeol的C-28氧化生成BA。

该研究开创性地将丝状真菌BA产量提升至工业应用级别，突破植物提取法的局限性。ZBS49基因组资源的挖掘为三萜合成途径改造提供新靶点，如调控CYP450基因可能进一步提升BA产量。未来可通过异源表达验证CYP450功能，或结合CRISPR技术构建工程菌株。该成果不仅为癌症治疗提供潜在药物来源，更确立了丝状真菌作为绿色生物制造平台的战略价值，推动微生物合成天然产物的产业化进程。