利用非进化型dCas9表观基因组编辑器在患者来源细胞中实现HTT基因的持久沉默

本研究针对亨廷顿舞蹈症(HD)这一致命性神经退行性疾病，开发了一种基于CRISPRoff系统的表观遗传编辑策略。研究人员通过将KRAB和DNMT3A/L效应结构域融合至SpdCas9，在HEK293、K562和患者来源神经干细胞中实现了HTT基因的持久沉默（最长6周），并证实该技术能特异性增加HTT启动子区DNA甲基化（提升22%），同时保持较低的脱靶效应。该研究为HD等显性遗传病的治疗提供了新思路。

　　

亨廷顿舞蹈症(HD)是一种令人闻之色变的遗传性神经退行性疾病，患者通常在发病后10-15年内死亡。这种疾病的罪魁祸首是HTT基因外显子1中的三核苷酸重复扩增，导致突变蛋白形成有毒聚集体，引发神经元功能障碍和死亡。尽管科学家们已尝试使用反义寡核苷酸(ASO)和RNA干扰等技术来降低HTT表达，但这些方法存在局限性：无法解决突变HTT转录本本身的毒性，且需要反复给药。更棘手的是，传统的CRISPR-Cas9基因编辑技术由于会造成DNA双链断裂，可能激活肿瘤抑制通路，并不适合用于HD治疗。

面对这些挑战，加州大学戴维斯分校健康中心的研究团队另辟蹊径，开发了一种基于表观遗传学的"基因沉默"策略。他们采用无核酸酶活性的dCas9蛋白，融合KRAB（诱导异染色质形成）和DNMT3A/L（催化DNA甲基化）效应结构域，构建了CRISPRoff系统。这种创新方法能在不改变DNA序列的情况下，通过表观遗传修饰持久抑制HTT基因表达。相关研究成果发表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》上。

研究人员运用了多项关键技术：比较不同dCas9变体（SpdCas9、VQR和dxCas9）的沉默效率；通过染色质免疫沉淀(ChIP)-qPCR分析蛋白与DNA结合；采用简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)评估全基因组DNA甲基化状态；在HEK293、K562和患者来源神经干细胞(NSC)等多种细胞模型中验证沉默效果；通过Western blot检测HTT蛋白水平变化。特别值得注意的是，研究中使用的ND36998G神经干细胞系来自HD患者诱导多能干细胞(iPSC)分化，具有重要的临床相关性。

"CRISPRoff可以显著下调HEK293细胞中的HTT"部分显示，针对HTT启动子区设计的8个sgRNA中，sgRNA 6和34分别使HTT表达降低47%和45%。有趣的是，HTT表达水平与细胞类型相关，HEK293中的表达量(FPKM=14.73)显著高于K562(6.618)和神经前体细胞(9.772)。

"进化的dCas9变体下调HTT效率低下"部分揭示了令人惊讶的发现：虽然测试了多种dCas9变体，但只有SpdCas9能显著降低HTT表达（84%），而VQR和dxCas9效果较差（26%）或无效。ChIP-qPCR显示这种差异源于结合效率：SpdCas9在HTT启动子的富集程度比VQR和dxCas9分别高10倍和50倍。Western blot证实CRISPRoff处理使HTT蛋白水平显著降低。

"CRISPRoff诱导HTT启动子强烈的DNA甲基化"部分通过RRBS分析发现，处理组HTT启动子区甲基化水平从对照组的3%提升至25%，且这种增加延伸至5'UTR（39%）、外显子1（27%）和内含子1（27%）。值得注意的是，唯一未发生甲基化增加的区域正是sgRNA结合位点。

"CRISPRoff诱导少量脱靶高甲基化基因"的全基因组分析显示，仅有321个基因启动子出现超甲基化，其中仅9个与预测的脱靶位点重叠。最重要的是，邻近基因GRK4（距sgRNA结合位点111kb）的甲基化状态未受影响，证明该系统具有高度特异性。

"CRISPRoff可在K562细胞中诱导长达6周的HTT长期下调"证明表观遗传沉默的持久性。即使7天后检测不到dCas9 mRNA，HTT表达抑制仍持续至少49天。ChIP-qPCR分析揭示这种持久沉默与H3K9me3（而非H3K27me3）修饰在HTT启动子的特异性富集相关。

"CRISPRoff在患者来源神经干细胞中诱导HTT显著下调"部分展示了该技术的临床潜力。在HD患者iPSC分化的NSC中，sgRNA 6使HTT表达降低48%。虽然这些细胞对嘌呤霉素选择敏感，但结果仍表明CRISPRoff在疾病相关细胞类型中有效。

这项研究的意义在于：首次证明非进化型SpdCas9在表观遗传编辑中的优越性；建立了一种持久（至少6周）、可逆的HTT沉默方法；在患者来源NSC中验证了治疗效果；为HD等显性遗传病提供了新治疗思路。特别值得注意的是，与需要持续给药的ASO相比，这种"一劳永逸"的表观遗传编辑策略可能更适合HD等慢性进展性疾病。然而，研究也指出当前系统在实现等位基因特异性沉默方面的局限性，提示未来需要探索其他dCas蛋白或优化sgRNA设计来区分突变型和野生型HTT。这项开创性工作为表观遗传编辑治疗神经退行性疾病奠定了重要基础。