单链HDR模板结合截短Cas12a结合序列显著提升原代人类T细胞的基因敲入效率

这篇研究展示了线性单链DNA(ssDNA)供体通过双链Cas靶序列(ssCTS)末端修饰，可显著提高AsCas12a介导的人类T细胞基因敲入效率，最高达90%，且毒性低、全长转基因整合更完整。该研究为基于CRISPR的非病毒基因编辑平台提供了重要优化策略。

　　

截短Cas12a结合序列优化单链HDR模板提升T细胞基因编辑效率

摘要
Wagner团队创新性地采用带有双链Cas靶序列(ssCTS)修饰的线性单链DNA(ssDNA)作为同源定向修复(HDR)模板，使AsCas12a介导的原代人类T细胞基因敲入效率突破性提升至90%。这一发现为CAR-T等细胞治疗产品的非病毒制备提供了高效、低毒的技术平台。

Cas12a编辑系统的独特优势
与传统SpCas9相比，AsCas12a具有三大特性：

1. 靶向AT富集区能力更强
2. 仅需42nt的crRNA简化生产流程
3. 高特异性减少脱靶效应
   研究采用经M537R/F870L突变增强的AsCas12a Ultra变体，其活性提升的同时保持了原始酶的高特异性。

模板设计的关键突破
通过系统优化CTS结构，发现：

• PAM"向内"取向比"向外"效率提升4.5倍
• crRNA靶序列4bp错配(tCTS)效果最佳
• 双末端修饰比单末端修饰效率更高
  在CD3ε位点插入0.8kb HLA-A2-TRuC时，ssCTS模板使90%的T细胞实现转基因表达，且细胞活力保持>95%。

ssDNase活性的关键验证
通过体外实验证实：

• 生理Mg²⁺浓度(0.2-1mM)下未检测到ssDNA降解
• 高Mg²⁺(10mM)才会激活非特异性切割
  这一发现消除了对ssCTS模板稳定性的担忧。

多维度性能验证

1. 编辑效率：

• CD3ζ位点1kb CAR插入效率达44%
• TRAC位点2kb CAR插入效率35%

1. 安全性：

• 长读长测序显示ssCTS组完全整合率达80%
• 部分整合事件比ssDNA组减少60%

1. 功能性：
   CAR-T细胞在连续肿瘤刺激中展现持续扩增能力(5.9倍)

临床转化意义
该技术突破解决了三大行业痛点：

1. 替代昂贵的病毒载体系统
2. 避免转座酶导致的随机插入风险
3. 实现TRAC等难编辑位点的高效修饰
   特别适用于：

• 肿瘤免疫治疗(CAR-T/TCR-T)
• 自身免疫病(Treg细胞改造)
• 器官移植(HLA特异性Treg)

未来展望
研究者指出，下一步将探索：

1. 更大片段(>3kb)ssCTS模板的生产工艺
2. 与DNA修复调节剂的联合使用
3. 新型递送系统(如脂质纳米颗粒)的适配

这项研究标志着非病毒基因编辑技术向临床级应用迈出了关键一步，为个性化细胞治疗的工业化生产提供了可靠解决方案。