基于CRISPR/LbCas12a系统的热带疾病快速检测技术TropD-Detector在克氏锥虫诊断中的应用研究

为解决克氏病(Chagas disease)在传播媒介和宿主动物中检测成本高、耗时长的问题，研究人员开发了基于CRISPR/LbCas12a系统的荧光检测原型TropD-Detector。该技术通过靶向Cytb基因实现118 parasites/mL的检测灵敏度，为热带地区提供了便携、经济的分子诊断方案，对疾病防控具有重要意义。

　　

克氏病（Chagas disease，CD）作为由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的人畜共患病，其传播媒介锥蝽和宿主动物（如负鼠）的检测一直是防控难点。传统诊断方法面临设备依赖性强、操作复杂等瓶颈，尤其在资源有限的拉美地区。工业桑坦德大学热带疾病研究中心团队在《Scientific Reports》发表的研究，创新性地将CRISPR基因编辑技术转化为诊断工具，开发出名为TropD-Detector的便携式检测系统。

研究采用CRISPR/LbCas12a系统结合重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，靶向锥虫保守基因Cytb、SR18s和H2A。通过生物信息学设计特异性gRNA，利用Cas12a的顺式/反式切割特性，建立荧光信号检测体系。样本来自哥伦比亚布卡拉曼加地区自然感染的棕榈锥蝽（Rhodnius pallescens）和实验室培养的Silvio X10株系，以及野生负鼠（Didelphis marsupialis）血液。

【主要技术方法】

1. 生物信息学分析：筛选Cytb、SR18s和H2A基因保守区域，设计24bp gRNA和扩增引物
2. 样本处理：从锥蝽中肠和负鼠血液提取DNA，qPCR定量寄生虫载量
3. 双重扩增：比较传统PCR（90分钟）与等温RPA扩增（20分钟）效率
4. CRISPR检测：优化LbCas12a/gRNA复合物浓度，采用FAM标记的ssDNA荧光报告系统
5. 设备开发：集成480nm LED激发光源和500nm高通滤光片，适配智能手机成像

【研究结果】

1. 靶标验证：
   Cytb gRNA在凝胶电泳中呈现481bp/241bp特征条带，而SR18s和H2A因靶点突变导致检测失败。测序显示Cytb靶区高度保守，无INDEL变异。

2. 灵敏度测试：
   PCR-CRISPR联用检测限达118 parasites/mL，RPA-CRISPR体系灵敏度提升至116 parasites/mL。稀释实验显示1ng/μL浓度仍可产生显著荧光信号（p<0.05）。

3. 跨样本验证：
   系统在培养株系、锥蝽中肠和负鼠血液三类样本中均保持稳定性能，荧光强度差异与寄生虫载量正相关（培养株vs野外样本p=0.000189）。

4. 设备性能：
   TropD-Detector原型机通过9V电池驱动，其检测结果与分光光度计（RFU>20,000）和紫外透射仪高度一致，且避免紫外线致癌风险。

【结论与意义】
该研究首次实现CRISPR/LbCas12a系统对克氏锥虫多宿主样本的现场检测，其创新性体现在：

1. 技术整合：将RPA等温扩增与CRISPR检测温度统一至37°C，简化操作流程
2. 成本控制：将ssDNA报告探针浓度降至100nM，较同类研究降低10倍
3. 应用拓展：设备材料成本不足200美元，适合基层医疗机构使用

局限性在于尚未整合DNA提取步骤，未来可结合EZ-Fast等快速提取方法完善系统。研究者强调，该技术平台可扩展至其他热带病诊断，为"同一个健康"（One Health）理念下的疾病监测提供新工具。