预混策略实现立方相脂质纳米粒对长链RNA的高效负载：突破核酸递送稳定性瓶颈

为解决长链RNA在立方相脂质纳米粒(cubosomes)中难以稳定封装的技术难题，韩国科学技术研究院团队创新性提出预混策略，成功将长达4000碱基的RNA封装于保持QIIP立方相结构的纳米粒中。该研究通过微流控预混技术使RNA在脂质前体中局部分布，结合冷冻电镜断层扫描和同步辐射SAXS证实RNA形成各向同性相排列。所得复合物在室温储存24天后仍保持90%以上的转染效率，为开发无需冷链的mRNA疫苗提供了全新解决方案。

　　

在生物医药领域，核酸药物的递送始终面临"最后一公里"的挑战。2023年诺贝尔生理学或医学奖授予mRNA疫苗研发者后，如何突破现有脂质纳米粒(LNP)的稳定性瓶颈成为焦点。传统LNP的无定形结构导致RNA在室温易降解，必须依赖冷链运输；而具有逆双连续立方结构的立方相脂质纳米粒(cubosomes)虽具备优异物理稳定性和内体逃逸能力，却因孔径限制难以负载长链RNA。这一矛盾成为制约核酸药物发展的关键瓶颈。

韩国科学技术研究院Hojun Kim团队在《Nature Communications》发表的研究中，通过革命性的预混策略破解了这一难题。研究人员采用微流控交错人字混合器(SHM)，将加热解链的RNA与含DOTAP阳离子脂质的乙醇溶液预混形成脂质-RNA前体，经温和热退火处理后成功制备出负载4kb RNA的立方相纳米粒(Q_II^P,RNA)。研究运用冷冻电镜断层扫描、同步辐射小角X射线散射(SAXS)和超分辨荧光显微技术，系统揭示了复合物的形成机制与结构特征。

【Premixing strategy for long RNA encapsulation in cubosomes】
研究团队发现传统后混合法会导致立方相向六方相转变，而预混策略通过将RNA限制在微小脂质液滴内，显著降低了RNA对整体结构的影响。微流控过程中，65℃加热使单链RNA获得柔性构象，促进其与阳离子脂质的静电相互作用，形成约39nm的脂质-RNA前体液滴。

【Mechanism of cubosome-long RNA complex formation】
原位冷冻电镜显示，前体液滴在6分钟退火过程中快速融合并自组装为140nm的立方相颗粒，速度比无RNA体系快50%。SAXS检测到q=0.12?^-1的特征峰，对应RNA的周期性排列。共聚焦显微镜测得脂质与RNA的皮尔逊相关系数达0.981，证实RNA高效包载。

【Structure of cubosome-long RNA】
SAXS分析显示复合物晶格参数从174?降至151?，水通道半径从35?缩小至28?。冷冻电镜断层扫描三维重建发现，RNA局部区域呈现无序拓扑结构，而整体保持立方相。电子密度分析表明RNA影响范围约50nm，形成d间距51?、域尺寸550?的各向同性相。

【Delivery performance】
在肝细胞(HepG2)和肝星状细胞(LX2)等难转染细胞中，复合物对1kb RNA的递送效率比传统LNP高4倍。4.4kb Cas9 mRNA的胞内水平是脂质体对照的4倍。室温储存24天后，凝胶电泳未检测到RNA降解，转染效率保持稳定。

该研究首次实现了长链RNA在立方相纳米粒中的稳定负载，其创新性体现在三方面：预混策略通过空间限制效应维持立方相结构；发现RNA在纳米粒中形成各向同性相的特殊排列方式；突破性解决了核酸药物室温储存的难题。研究不仅为开发无需冷链的mRNA疫苗铺平道路，更为肽类/聚合物等大分子载体的设计提供了新思路。韩国团队申报的相关专利(10-2023-0015749等)预示着该技术潜在的临床转化价值，特别是在CRISPR基因治疗和肿瘤疫苗等领域的应用前景。