空间阻隔分裂CRISPR-Cas12a系统：超灵敏多功能小分子激活与检测新策略

为解决传统小分子检测方法复杂设计、高背景噪音及靶标适应性受限等问题，华中科技大学团队开发了基于空间阻隔分裂CRISPR-Cas12a系统（SBS-Cas）。该研究通过分子结合诱导的支架链空间位阻效应，实现了对生物素（10 nM）、m6A（1 nM）、谷胱甘肽（20 pM）等小分子的超灵敏检测，并成功应用于活细胞内GSH动态成像。这一创新技术为临床诊断、环境监测及食品安全领域提供了低背景、高通用性的检测平台。

　　

在生命科学和医学检测领域，小分子（分子量<1000 Da）如葡萄糖、胆固醇、环境毒素等的精准检测对疾病诊断和生态安全至关重要。然而，传统方法如气相色谱-质谱（GC-MS）和ELISA面临设备依赖性强、操作复杂或灵敏度不足等挑战。尽管CRISPR-Cas12a系统因其高特异性成为新兴检测工具，但现有技术仍受限于核酸适配体（aptamer）的"呼吸效应"和抗体-抗原结合的背景噪音，难以实现低浓度小分子的稳定检测。

针对这一瓶颈，华中科技大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性成果。他们开发了空间阻隔分裂CRISPR-Cas12a系统（Spatially Blocked Split CRISPR-Cas12a, SBS-Cas），通过将crRNA拆分为支架链（scaffold）和间隔链（spacer），并在支架链3'端修饰小分子。当大分子（如抗体、链霉亲和素）与小分子结合时，产生的空间位阻可完全抑制Cas12a的转切割（trans-cleavage）活性；而待测小分子通过竞争性结合解除位阻，从而激活信号输出。

研究团队运用了四项关键技术：1）分裂crRNA设计验证Cas12a功能模块化；2）多类型分子结合反应（如抗原-抗体、迈克尔加成）构建通用检测接口；3）单核苷酸DNA延伸策略（1nt DNA-extended scaffold）简化RNA修饰难度；4）脂质体递送系统实现活细胞内GSH动态成像。

研究结果
SBS-Cas检测原理验证
通过丙烯酰胺（acrylamide）模型证实：DNA屏障链（DNA barrier-SH）与修饰支架链（scaffold-acryl）的巯基加成反应可产生空间位阻，使荧光信号降低至背景水平（ΔF<5%），而游离丙烯酰胺竞争性结合后信号恢复（ΔF>80%）。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）显示，位阻组底物链（150-nt ssDNA）保持完整，而竞争组出现明显降解。

生物素检测体系优化
基于生物素-链霉亲和素（SA）的超强结合力（K_d≈10^-14 M），研究发现SA浓度与信号抑制呈正比（1x=20 nM时抑制率达95%）。优化竞争孵育时间至1小时后，检测限达10 nM，且对GSH、葡萄糖等干扰物无交叉反应。

m6A甲基化检测突破
在支架链3'端引入m6A修饰（scaffold-m6A1）后，抗m6A抗体可产生203.6倍信噪比，远超传统 spacer 阻断策略。通过PBS缓冲体系优化，实现了1 nM检测灵敏度，并能区分m6A与腺苷（A）、胞苷（C）等碱基。

GSH超灵敏检测与活体应用
利用马来酰亚胺（maleimide）与巯基的迈克尔加成反应，DNA屏障链（DNA barrier-malei）在1.8倍过量时实现零背景。该体系对GSH的检测限达20 pM，较现有技术提升100倍。通过铁死亡抑制剂（Fer-1）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂（BSO）处理宫颈癌细胞（SiHa），荧光成像成功捕获了细胞内GSH/GSSG氧化还原态的波动。

1nt DNA延伸策略拓展靶标范围
将支架链3'端延长单个脱氧核苷酸（dA/dT/dC/dG）后，仍保留Cas12a激活能力。该策略成功应用于嘌呤霉素（puromycin）、5-甲基胞嘧啶（5mC）和叶酸（folic acid）检测，其中叶酸受体α蛋白（FOLR1）结合体系显示出浓度依赖性信号激活。

结论与意义
该研究首次揭示了分子结合诱导的空间位阻对Cas12a活性的调控机制，突破了CRISPR检测小分子的三大瓶颈：1）简化设计（仅需3'端修饰）；2）背景信号降低10倍以上；3）靶标范围扩展至非核酸物质。通过整合点击化学（click chemistry）等反应类型，SBS-Cas为重金属、农药残留等环境污染物检测提供了新思路。活细胞成像结果进一步验证了该系统在复杂生物环境中的稳定性，为代谢性疾病（如糖尿病、神经退行性疾病）的分子机制研究提供了动态监测工具。这项技术有望推动CRISPR从基因编辑工具向多学科交叉检测平台的转型。