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为解决血浆 EVs 分离时高浓度血浆蛋白干扰低丰度 EV 相关蛋白检测的问题，研究人员开展 SEC 结合 Capto Core 700 珠分离血浆 EVs 的研究，发现 qEV+CCS 法可获高纯度 EVs，鉴定超 1000 种蛋白，为 EV 生物标志物开发提供工具。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的关键介质，在疾病诊断领域展现出巨大潜力，尤其是血液中的 EVs，因其无创性和动态性成为研究热点。然而，从血液中分离 EVs 面临严峻挑战 —— 血浆中高浓度的蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白等）如同 “迷雾”，不仅掩盖低丰度 EV 相关蛋白的信号，还会干扰后续的质谱分析，导致难以捕捉到与疾病密切相关的生物标志物。在神经退行性疾病领域，如阿尔茨海默病，如何从复杂的血液环境中精准分离 EVs 并挖掘其携带的病理相关蛋白，成为阻碍该领域生物标志物开发的关键瓶颈。
为突破这一困境，美国梅奥诊所（Mayo Clinic）的研究人员开展了一项具有创新性的研究。他们聚焦于优化血浆来源 EVs 的分离方法，旨在建立一种高效、快速且能最大限度保留 EV 完整性和蛋白覆盖深度的技术体系。历经多次方法学探索与对比，研究团队最终在《Cell Communication and Signaling》上发表了他们的成果，为 EVs 研究领域提供了新的技术范式。
主要关键技术方法
研究采用了多种先进技术：首先利用尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC）分离 EVs，获取初步富集的 EV 组分；随后引入 Capto Core 700 珠进行流穿色谱处理，通过不同孵育时间（5 分钟、1 小时）优化蛋白去除效率；同时以 MagReSyn 磁珠法作为对照。在 EV 表征方面，运用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、冷冻电镜（Cryo-EM）、纳米流式细胞术（NanoFCM）等技术评估 EV 的粒径分布、浓度和形态。蛋白质组学分析则借助数据非依赖采集质谱（Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry, DIA-MS），结合超分辨率显微镜（如 dSTORM）进行单 EV 水平的验证，全面揭示 EV 的蛋白组成和功能关联。
研究结果
混合色谱法对血浆 EVs 的纯化效果
通过五种方法（qEV、CC+qEV、qEV+CCL、qEV+CCS、MagReSyn）的对比发现，qEV 结合 Capto Core 700 珠的方法显著提升 EV 纯度。NTA 和 NanoFCM 显示，qEV+CCS 组 EV 粒径分布更集中，且小囊泡富集明显，而长时间孵育的 qEV+CCL 组 EV 浓度显著下降，提示孵育时间可能影响 EV 回收率。银染色和微 BCA 分析表明，qEV+CCS 组的血浆蛋白（如 ALB、IGG1）污染最少，EV 颗粒与蛋白比值最高，证实其纯化效率最优。
不同方法的蛋白质组学特征
DIA-MS 分析显示，qEV+CCS 组鉴定出 1153 种蛋白，显著多于其他组，且经典 EV 标志物（如 CD9、CD63、TSG101）表达水平更高，而高丰度血浆蛋白丰度显著降低。通路分析发现，qEV+CCS 组特有的蛋白富集于 RNA 结合、细胞黏附、突触功能等通路，与神经退行性疾病密切相关。此外，该组检测到更多脑源性蛋白，如淀粉样前体蛋白（APP）和载脂蛋白 E（APOE），这些蛋白与阿尔茨海默病等病理过程直接相关。
单颗粒分析与神经退行性疾病标志物验证
超分辨率显微镜证实，qEV+CCS 组中 CD63+EV 亚群以及 APP+、APOE+双阳性 EV 比例显著高于其他组，从单颗粒水平验证了该方法对病理相关 EV 的富集能力。细胞类型富集分析显示，qEV+CCS 组的中枢神经系统（CNS）细胞标志物（如内皮细胞、胶质细胞蛋白）比例最高，进一步支持其在捕捉脑源性 EV 方面的优势。
研究结论与讨论
本研究建立的 qEV+CCS 方法通过 SEC 与 Capto Core 700 珠的巧妙结合，仅需 5 分钟短时间孵育即可高效去除血浆蛋白污染，同时保留完整 EV 结构，实现了 EV 纯度和蛋白覆盖深度的双重提升。该方法不仅解决了传统分离技术中纯度与回收率难以平衡的问题，还通过蛋白质组学和单颗粒分析揭示了 EV 在神经退行性疾病中的潜在生物标志物，如 APP、APOE 等，为无创性疾病诊断提供了新方向。
值得注意的是，尽管 qEV+CCS 组仍存在脂蛋白（如 APOB）的共分离，但相较于高丰度血浆蛋白，其对 EV 特异性信号的干扰显著降低。研究结果为后续大规模临床样本中 EV 生物标志物的开发奠定了方法学基础，尤其在神经退行性疾病领域，有望推动基于血浆 EV 的早期诊断和疗效监测技术的突破。此外，该方法的可扩展性和标准化潜力，使其在其他疾病（如癌症、心血管疾病）的 EV 研究中具有广泛应用前景。
