综述：优化猪基因编辑：电穿孔和脂质体转染的作用

这篇综述系统探讨了CRISPR/Cas9系统在猪基因编辑中的应用，重点对比了电穿孔（electroporation）和脂质体转染（lipofection）两种非传统递送技术的优势与挑战。文章指出，相较于体细胞核移植（SCNT）和显微注射（microinjection），这两种方法在成本效益、操作简便性和高通量潜力方面表现突出，尤其适用于农业育种（如肌肉发育基因MSTN编辑）和生物医学研究（如异种移植靶点GGTA1/CMAH/B4GALNT2三重敲除）。作者团队通过优化电压参数（25-30 V/mm）、脉冲次数（3-7次）和脂质体浓度（5% CRISPRMAX），显著提高了胚胎存活率和突变效率，但嵌合体（mosaicism）和单等位基因编辑问题仍需突破。

　　

引言

基因组工程在猪（Sus scrofa）中的应用正迅速扩展，这得益于CRISPR/Cas9系统的普及。该系统由Cas9核酸酶和引导RNA（gRNA）组成，通过识别靶序列（20个核苷酸+NGG的PAM序列）产生双链断裂（DSB），经非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）实现基因敲除（KO）或敲入（KI）。猪因其与人类相似的解剖和生理特征，成为研究人类疾病（如糖尿病模型PDX1 KO）和异种移植的理想对象。此外，农业领域通过编辑CD163基因可增强猪对PRRSV的抗性，而肌肉发育相关基因MSTN的编辑能显著提升肉质产量。

电穿孔技术

原理与优化

电穿孔最初用于猪卵母细胞激活和克隆胚胎融合，现已成为递送CRISPR组分的核心方法。其原理是通过电场瞬时形成膜孔，使外源分子进入细胞。猪卵母细胞和受精卵的最佳参数为25-30 V/mm电压、1 ms单极脉冲（4-6次），采用Opti-MEM缓冲液可平衡编辑效率与胚胎存活率。例如，Tanihara团队首次用该方法成功获得MSTN KO猪，突变率达50%以上。

关键影响因素包括：

1. 电压与极性：30 V/mm单极脉冲可减少细胞凋亡；
2. 处理时机：受精后13小时电穿孔囊胚率最高；
3. CRISPR组分：Cas9蛋白（50 ng/μL）比mRNA更高效，而gRNA设计需通过算法预测避免脱靶效应；
4. 预处理：离心可降低脂滴干扰，而透明带（ZP）酶解虽提高突变率但损害胚胎活力。

应用案例

目前已生成9种基因编辑猪模型，包括：

• 单基因KO：TP53（癌症模型）、CD163（抗病毒）、GHR（异种移植）；
• 多基因编辑：GGTA1/CMAH双敲除和GGTA1/CMAH/B4GALNT2三敲除，显著降低异种器官排斥；
• 点突变：通过HDR将猪胰岛素基因（INS）改造为人源化版本，为糖尿病治疗提供新策略。

局限性在于嵌合体率高（约60%），且大片段插入效率低。

脂质体转染技术

突破与挑战

脂质体通过正电荷包裹CRISPR组分（Cas9/gRNA复合物），以内吞或膜融合方式进入细胞。早期研究需去除ZP，导致胚胎存活率仅8-15%。近期进展显示，Lipofectamine CRISPRMAX（5%浓度）在ZP完整卵母细胞中可实现20%囊胚率和35%突变率，但单等位基因编辑仍占主导。

优化方向包括：

• 时序：受精后8小时处理突变率最高（50%）；
• 复合载体：聚合物TransIT-X2与脂质体联用可提升递送效率；
• 毒性控制：延长孵育时间（>20小时）会显著抑制发育。

活体成果

Hirata团队通过脂质体转染ZP-free胚胎获得7头MSTN单等位基因编辑仔猪，证明其可行性，但规模化应用仍需解决嵌合问题。

未来展望

新型基因编辑工具如高保真Cas9变体（如Cas12a）、碱基编辑器（ABE/CBE）和Prime编辑器将提升精确度。递送系统方面，金纳米颗粒和杂交载体可能突破ZP屏障。当前，电穿孔在效率和稳定性上更胜一筹，而脂质体转染因其设备简易性更适合资源有限实验室。两者共同推动猪基因编辑从实验室走向产业化，为农业和医疗领域提供革新性解决方案。