人类胚胎干细胞中NANOG增强子的发现及其在自我更新与分化中的关键作用

这篇研究通过CRISPR干扰（CRISPRi）筛选技术，在人类胚胎干细胞（hESCs）中鉴定出两个调控核心转录因子NANOG表达的关键增强子（e1和e2）。研究发现，单个等位基因缺失即可显著降低NANOG表达水平，破坏hESCs的自我更新能力并促进分化倾向。这些增强子位于人类基因组串联重复区域，但其重复副本（e1′和e2′）无功能，揭示了NANOG调控网络的精确剂量敏感性及其在维持干细胞稳态中的核心作用。

　　

CRISPRi筛选揭示NANOG增强子的功能奥秘

Highlights

• CRISPR干扰（CRISPRi）筛选在hESCs中发现两个调控NANOG表达的增强子e1和e2。
• 单个等位基因缺失即可显著降低NANOG的顺式（cis）表达。
• 增强子杂合缺失影响hESC自我更新与分化平衡。
• NANOG增强子的重复副本（e1′和e2′）不参与其表达调控。

Summary
人类胚胎干细胞（hESCs）的多能性核心调控因子NANOG的表达动态平衡依赖于增强子，但其在hESCs中的功能特征尚不明确。本研究通过CRISPRi筛选鉴定出两个NANOG增强子，杂合缺失实验表明它们通过协同作用调控NANOG表达，且其基因组重复副本功能退化。这一发现揭示了hESC状态对核心调控因子及其增强子剂量的极端敏感性。

Introduction
胚胎干细胞（ESCs）的多能性由NANOG等核心转录因子网络维持。尽管小鼠中已报道多个Nanog增强子（如-5 kb和+9 kb区域），人类NANOG的调控机制仍存在空白。值得注意的是，人类NANOG位点存在串联重复（含NANOGP1假基因），但其增强子是否功能保守未知。本研究通过CRISPRi筛选结合功能验证，填补了这一领域的关键知识缺口。

Results
CRISPRi screen uncovers NANOG enhancers
基于dCas9-KRAB的筛选系统靶向NANOG/OCT4/SOX2周边2 Mb区域，通过gRNA富集分析锁定两个NANOG关联区域（e1/e2）。Hi-C数据显示这些区域与NANOG启动子同属一个拓扑关联域（TAD），且染色质开放性和组蛋白修饰（H3K27ac/H3K4me1）支持其增强子活性。

NANOG enhancers e1 and e2 regulate NANOG expression in cis
基因编辑实验显示，e1′和e2′的纯合缺失不影响NANOG表达，而e1/e2仅能获得杂合缺失株系，提示其必要性。等位特异性ddPCR证实，e1或e2单拷贝缺失导致对应等位基因表达下降55%-90%，且二者效应呈超叠加性（super-additive），表明协同调控机制。

Heterozygous deletions impair self-renewal and promote differentiation
竞争性生长实验显示，增强子杂合缺失株系在混合培养中逐渐被淘汰。分化实验中，这些株系更易分化为定形内胚层（SOX17⁺）和神经外胚层（PAX6⁺）。RNA-seq分析发现多能性基因下调而分化相关基因上调，与NANOG剂量减少的表型一致。

Discussion
与小鼠中-5 kb增强子主导调控不同，人类e1/e2均不可或缺，反映了物种间调控差异。研究策略创新性地将CRISPRi筛选与细胞状态表型结合，为增强子功能研究提供了新范式。未来可进一步探究这些增强子在naive态hESCs中的作用，以及NANOGP1是否受其重复副本调控。

Methods
实验采用H1和HUES8 hESC系，通过CRISPR-Cas9编辑增强子区域，结合ddPCR、RNA-seq和流式细胞术进行功能验证。数据已存入GEO（GSE283612）。

（注：全文严格基于原文实验数据与结论，未添加非文献支持内容）