hpCasMINI：一种具有增强基因编辑活性的超紧凑CRISPR-Cas12f系统

为解决基因治疗中CRISPR-Cas系统因体积过大难以有效包装至腺相关病毒（AAV）载体的问题，研究人员通过工程化改造超紧凑型CRISPR-Cas12f系统，开发出hpCasMINI。该研究通过在Un1Cas12f1变体CasMINI的N端添加α-螺旋结构，显著提升了基因激活和DNA切割活性（分别提高1.4-3.0倍和1.1-19.5倍），同时保持高特异性。hpCasMINI在成年小鼠肝脏中成功激活报告基因和内生Fgf21基因，并构建了肝肿瘤模型。此外，该策略还成功应用于OsCas12f1和AsCas12f1，开发出hpOsCas12f1和hpAsCas12f1，进一步扩展了微型基因编辑工具箱，为未来基因治疗提供了新工具。

　　

基因编辑技术近年来在基础研究和临床治疗中展现出巨大潜力，但传统CRISPR-Cas系统（如SpCas9和LbCas12a）因体积过大（通常超过1000个氨基酸），难以有效包装至腺相关病毒（AAV）载体中，限制了其在基因治疗中的应用。尽管已有一些超紧凑型CRISPR系统（如CasMINI、enOsCas12f1等）被开发出来，但其编辑效率远低于大型Cas蛋白，成为制约其广泛应用的主要瓶颈。

为解决这一问题，南方医科大学的研究团队通过结构优化策略，开发出一种新型超紧凑CRISPR-Cas12f系统——hpCasMINI。研究人员通过比较高活性Cas12a和低活性Cas12f的结构差异，发现Cas12a的N端存在一个α-螺旋结构，而Cas12f中缺失这一结构。基于这一发现，他们在CasMINI（一种工程化的Un1Cas12f1变体）的N端添加了α-螺旋结构，成功构建了hpCasMINI（554个氨基酸）。研究结果显示，hpCasMINI在哺乳动物细胞中的基因激活和DNA切割活性显著提升，分别达到CasMINI的1.4-3.0倍和1.1-19.5倍，同时保持了高特异性。

该研究采用了多种关键技术方法：1）结构比较和预测（使用AlphaFold）；2）报告基因系统（G5-mNeonGreen）评估基因激活效率；3）深度测序（Deep-seq）分析DNA切割效率；4）Tag-seq评估编辑特异性；5）小鼠体内实验（包括基因激活和肿瘤模型构建）。

Adding of an α-helix to the N-terminus of dCasMINI-VPR improves gene activation
研究人员通过比较Cas12a和Cas12f的结构差异，发现Cas12a的N端存在一个α-螺旋结构。通过在dCasMINI-VPR的N端添加不同α-螺旋结构（如Gp41S2），显著提高了基因激活效率。优化后的dhpCasMINI-VPR（S2-2EAK）在多个内源基因（如HBG1、IL1RN）中表现出更强的激活能力，且RNA-seq证实其具有高度特异性。

The hpCasMINI increases the DNA cleavage efficiency
hpCasMINI在10个基因组位点的DNA切割效率均显著高于CasMINI，其中SITE1位点的编辑效率从10.2%提升至75.2%。Indel分析显示，hpCasMINI产生的缺失更多且更长，切割峰值位于PAM远端区域（20-30 bp）。

The hpCasMINI exhibits high specificity for gene editing
Tag-seq分析表明，hpCasMINI的编辑特异性与CasMINI相当，特异性指数相似，且对gRNA错配和长度变化敏感。单碱基错配即可显著降低编辑效率，近端错配影响更大。

dhpCasMINI-VPR enhances gene activation in vivo
在小鼠肝脏中，dhpCasMINI-VPR能更有效地激活荧光素酶报告基因和内生Fgf21基因，激活效率分别为dCasMINI-VPR的3.9倍和4.7倍。Western Blot证实Fgf21蛋白表达显著增加。

Tumorigenesis modeling in mice with hpCasMINI
通过同时靶向Trp53和Pten基因并插入致癌突变Kras^G12D，hpCasMINI成功构建了小鼠肝内胆管癌模型。与CasMINI相比，hpCasMINI组小鼠肝脏肿瘤结节更多（5.3 vs. 1.8），肝脏重量更大（2.0 g vs. 1.4 g），且组织学分析显示明显的CK19阳性胆管癌特征。

Performance comparison of SpCas9, LbCas12a and hpCasMINI
在相同或相邻位点，dhpCasMINI-VPR的基因激活效率显著高于SpCas9和LbCas12a。DNA切割效率方面，hpCasMINI在部分位点（如SITE1、NLRC4）与SpCas9或LbCas12a相当，但整体活性较低。Tag-seq显示hpCasMINI的特异性显著高于SpCas9（特异性指数0.98 vs. 0.16），且脱靶位点更少（13 vs. 951）。

Miniature hpOsCas12f1 increases the DNA cleavage efficiency
将α-螺旋添加策略应用于enOsCas12f1（433个氨基酸），构建的hpOsCas12f1在7个位点的编辑效率提升1.2-2.5倍，且特异性与enOsCas12f1相当。

Miniature dhpAsCas12f1-VPR improves gene activation efficiency
在AsCas12f1（422个氨基酸）中应用相同策略，dhpAsCas12f1-VPR的基因激活效率提升6.7倍（HBG1）和5.3倍（IL1RN），且保持高特异性。

Miniature hpAsCas12f1 improves DNA cleavage efficiency
hpAsCas12f1在11个位点中的9个表现出更高的DNA切割效率（如NLRC4位点从35.7%提升至62.4%），且特异性指数与AsCas12f1相当（0.83 vs. 0.82）。

该研究通过“空间结构优化”策略，成功开发了hpCasMINI、hpOsCas12f1和hpAsCas12f1三种超紧凑且高效的基因编辑工具。这些系统不仅解决了AAV包装限制问题，还显著提升了编辑效率，为基因治疗提供了新的可能性。特别是hpCasMINI在小鼠模型中展现出优异的体内编辑能力，为未来临床应用奠定了基础。此外，该研究提出的结构优化策略可推广至其他CRISPR系统（如IscB和TnpB），为开发更多高效微型编辑器提供了新思路。研究成果发表在《Nature Communications》上，标志着超紧凑CRISPR系统向临床应用迈出了重要一步。