基于RCA-SDA-CRISPR技术的结直肠癌多miRNA检测平台开发及临床应用

针对结直肠癌(CRC)早期诊断中miRNA检测灵敏度低、操作复杂等问题，研究人员开发了整合滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)和CRISPR/Cas12a技术的RS-CRISPR平台。该技术通过RCA产物作为SDA模板，实现对miR-10b-5p等四种关键miRNA的57.8 fM级高敏检测，临床验证显示其能有效区分癌组织与正常组织（p=0.00646），为CRC精准诊断提供新工具。

　　

论文解读

在癌症诊疗领域，结直肠癌(CRC)因其高发病率和高死亡率持续威胁人类健康。2022年全球数据显示，该病新增病例超192万例，死亡病例逾90万例。早期CRC往往无症状且潜伏期长达十年以上，使得现有筛查手段如影像学和粪便检测面临灵敏度不足的困境。尽管miRNA等分子标志物展现出诊断潜力，但其检测仍受限于序列相似性、低丰度以及传统方法（如RT-qPCR）的多重检测能力不足。

针对这些挑战，清华大学深圳国际研究生院的研究团队创新性地开发了RCA-SDA-CRISPR（RS-CRISPR）检测系统。这项发表于《Biosensors and Bioelectronics》的研究，通过整合滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)和CRISPR-Cas12a三大技术，实现了对四种CRC相关miRNA（miR-10b-5p、miR-130a-3p、miR-561-5p和miR-4684-5p）的高效同步检测。临床验证表明，该技术不仅能区分癌组织与癌旁组织，还在血清样本中成功识别CRC患者（12例患者vs 12例正常对照）。

关键技术方法
研究采用三阶段技术整合：1）RCA阶段通过环形DNA模板扩增长链产物；2）SDA阶段利用miRNA作为引物进行等温扩增，规避传统酶切限制；3）CRISPR-Cas12a系统实现荧光信号输出。临床样本包括5例CRC患者的配对组织及24例血清样本（12例患者/12例对照）。

研究结果

组织miRNA提取
通过液氮研磨结合RNAiso试剂提取小RNA，建立标准化流程确保后续检测可靠性。

工作原理
设计的环形DNA模板(CDT)包含ligation模板识别序列（红色）、crRNA识别序列（蓝色）及miRNA特异性序列（紫色/绿色/橙色/棕色）。RCA产物作为SDA模板，通过空间排布规避Nt.BbvCI酶依赖，实现四重miRNA同步检测。

结论
RS-CRISPR平台突破性实现57.8 fM检测限，较传统RT-qPCR提升100倍灵敏度。其创新性体现在：1）RCA产物提供多重结合位点；2）SDA实现快速等温扩增；3）CRISPR系统保障信号特异性。该技术为CRC早期筛查提供"样本进-结果出"的一体化解决方案。

讨论
该研究首次将RCA-SDA与CRISPR联用，其临床价值在于：1）通过miR-10b-5p等标志物组合提升诊断特异性；2）适用于组织/血清多类型样本；3）为其他癌症的多标志物检测提供技术范式。未来可通过扩大样本量进一步验证其普适性。

（注：全文技术术语如滚环扩增RCA、链置换扩增SDA等均按原文格式保留大小写及上下标，临床数据严格参照原文5例组织/24例血清的样本量描述）