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本文聚焦 JC 病毒（JCV）引发的进行性多灶性白质脑病（PML），介绍一种新型 CRISPR 抗病毒疗法。该疗法利用双 gRNA 结合 SaCas9，靶向 JCV 的大肿瘤抗原（LT-Ag）和衣壳蛋白 VP1，在 2D、3D 模型中均有效抑制病毒，为 PML 治疗带来新希望。
进行性多灶性白质脑病（PML）由 JC 病毒（JCV）引起，JCV 可裂解少突胶质细胞，导致中枢神经系统脱髓鞘。目前 PML 缺乏有效治疗手段，传统治疗主要针对免疫抑制而非病毒本身。
基因编辑技术为抗病毒治疗提供新方向，CRISPR 可特异性靶向病毒 DNA 或 RNA 基因组。本研究开发一种双 gRNA（靶向 JCV 的大肿瘤抗原 LT-Ag 和衣壳蛋白 VP1）结合 SaCas9 的 CRISPR 抗病毒疗法，并利用慢病毒包装。
研究首先在传统二维（2D）细胞培养模型（SVGA 星形胶质细胞）中验证。通过慢病毒接种和嘌呤霉素筛选获得重组细胞系，感染后经桑格测序证实 JCV 环状双链 DNA 基因组被均匀切除，定量 PCR（qPCR）显示病毒载量显著降低，蛋白质印迹（western blot）检测到病毒蛋白减少，且病毒后代的感染性降低。
为提升结果的转化性，研究进一步在三维（3D）异质性人脑海器官（COs）模型中验证。COs 由诱导多能干细胞（iPSCs）逐步分化而来，包含神经元和神经胶质细胞，可模拟天然大脑的解剖连接。感染 JCV 后用慢病毒包装的 CRISPR 抗病毒疗法处理，测序证实病毒基因组被截断，qPCR、免疫荧光成像显示病毒载量和蛋白水平降低，病毒后代感染性下降。
研究还对 CRISPR 构建体进行优化，通过生物信息学软件设计 gRNA，比较不同组合的效果，发现靶向 LT-Ag 和 VP1 的双 gRNA 组合效果最佳。将 gRNA 盒分离可提高表达水平，稳定细胞系中病毒基因组被完全切除，病毒蛋白表达被完全抑制。
在 COs 模型中，JCV 主要感染星形胶质细胞和少突胶质细胞，而神经元感染较少，这与临床研究一致。感染后用 CRISPR 疗法处理，COs 中的病毒载量显著降低，免疫荧光显示病毒蛋白减少，且病毒后代的感染性在不同 multiplicity of infection（MOI）下均显著降低。
该研究表明，CRISPR 基因编辑在 2D 和 3D 细胞培养模型中均能有效抑制 JCV 感染，为治疗目前无法治愈的 JCV 和 PML 提供了新的潜在策略。未来需进一步优化治疗滴度、治疗时机和递送载体，并在动物模型中验证安全性和有效性。
